一种抗体的纯化方法技术

本发明专利技术提供一种抗体的纯化方法，包括细胞发酵液沉淀、复合模式层析以捕获抗体、以及再次层析分离抗体以对抗体进行精细纯化的步骤，解决了目前ProteinA亲和层析的制备单克隆抗体成本高、样品中含有Protein A蛋白分子残留、非proteinA方法制备抗体纯度差等缺陷，具有操作简单、纯化效率高、样品损失少和纯化出的抗体纯度高、可以用于工艺的放大的优点。可以用于工艺的放大的优点。可以用于工艺的放大的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种抗体的纯化方法


[0001]本专利技术涉及蛋白纯化
，尤其是涉及一种抗体的纯化方法。

技术介绍

[0002]目前，抗体药物的制备过程一般使用的ProteinA亲和填料做为第一步目标单克隆抗体的捕获方法，它是将ProteinA蛋白分子通过化学键偶联的方式连接到固定的基架上面，在含有目标抗体的发酵液经过填料时，单克隆抗体分子与ProteinA蛋白分子发生特异性结合，从而将发酵液中的抗体分子捕获，在通过一定的洗脱方式(一般为酸性洗脱方式)减弱抗体与ProteinA分子的结合力，从而将目的抗体洗脱下来，ProteinA亲和层析捕获抗体具体特异性强、纯度高、载量高、回收率高等优点。但是ProteinA亲和层析填料的制备过程复杂，填料的价格较高，而且有引入外源性蛋白的风险，给单克隆抗体的商业化制备带来了很大的挑战，开发一种非ProteinA亲和层析单克隆抗体的制备方法，成为行业发展的一种要求和趋势。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供的抗体纯化方法，具有操作简单、纯化效率高、样品损失少和纯化出的抗体纯度高、可以用于工艺的放大的优点。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
[0005]本专利技术提供了一种纯化抗体的方法，包括以下步骤：
[0006]a)细胞发酵液沉淀；
[0007]b)复合模式层析以捕获抗体；
[0008]c)再次层析分离抗体以对抗体进行精细纯化；
[0009]其中，步骤a)中的发酵液以酸性溶液调节发酵pH至设定值，静置30
‑
60分钟后离心获得含抗体粗品的上清液，所得发酵液电导率不超过20mS/cm；将步骤(a)中获得的发酵液加载到步骤b)的预处理好的复合模式层析填料上，用平衡缓冲液清洗复合模式层析填料、用洗脱缓冲液洗脱并收集洗脱液；步骤c)中再次层析分离抗体的方式包括亲和层析、疏水层析或阳离子交换层析中的至少一种。
[0010]进一步，本专利技术的步骤a)的调节pH的酸性溶液包括冰乙酸、盐酸、柠檬酸中的至少一种，优选柠檬酸。
[0011]进一步，本专利技术的步骤a)的调节pH的酸性溶液的浓度为2mol/L。
[0012]进一步，本专利技术的调节发酵pH至4
‑
5，优选4.5
±
0.2。
[0013]进一步，本专利技术的步骤a)的静置时间为45分钟。
[0014]进一步，本专利技术的步骤b)复合模式层析填料为Capto MMC。
[0015]进一步，本专利技术的步骤b)的平衡缓冲液含有浓度为50mmol/L的NaAC
‑
HAC溶液，pH为4.5
‑
5.5，优选PH为5.5；
[0016]洗脱缓冲液含有浓度为200mmol/L的Tris
‑
HCl和浓度为1mol/L的NaCl溶液，pH为
8.0。
[0017]进一步，本专利技术的步骤c)中再次层析分离抗体的方式为疏水层析和阳离子交换层析两步法。
[0018]进一步，本专利技术所述疏水层析填料为Phenyl，阳离子交换层析填料为SPFF；
[0019]进一步，本专利技术所述Phenyl疏水层析时的平衡缓冲液含有浓度为20mmol/L的PB和浓度为1.1mol/L的(NH)4SO4溶液，pH为7.0，
[0020]洗脱缓冲液含有浓度为20mmol/L的PB溶液，pH为7.0；
[0021]所述SPFF阳离子交换层时平衡缓冲液含有浓度为20mmol/L的Na2HPO4·
12H2O
‑
柠檬酸溶液，pH为5.2，
[0022]洗脱缓冲液含有浓度为20mmol/L的Na2HPO4·
12H2O
‑
柠檬酸溶液和浓度为0.5mol/L的NaCl溶液，pH为5.2。
[0023]进一步，本专利技术在步骤b)之后、步骤c)之前还包括低pH孵育病毒灭活的步骤。
[0024]进一步，本专利技术在步骤c)之后还包括除病毒过滤、超滤浓缩的步骤。
[0025]进一步，本专利技术所述抗体的纯化方法，其所述抗体为TNF
‑
a单克隆抗体。
[0026]本专利技术还提供了一种使用上述抗体的纯化方法纯化得到的抗体。
[0027]本专利技术还提供了上述抗体的纯化方法在制备抗体药物中的应用。
[0028]步骤a)的发酵液沉淀主要目的为去除发酵液里面的杂质蛋白，使后续层析纯化的抗体纯度更加高。具体为：将发酵液用2mol/L柠檬酸溶液调节pH至4.5
±
0.2，发酵液出现浑浊现象，静置30分钟到60分钟，将浑浊的发酵液经过离心机离心，3500rpm，10min去除沉淀取上清，将发酵液上清液加入2mol/L Tris
‑
HCl溶液，调节样品pH至5.5
±
0.2，确认电导不超过20mS/cm。
[0029]步骤b)的复合模式层析以捕获抗体，具体为：
[0030]平衡缓冲液A：50mmol/L NaAC
‑
HAC，pH5.5
[0031]洗脱缓冲液B：200mmol/L Tris
‑
HCl+1mol/L NaCl，pH8.0
[0032]清洁缓冲液：0.5mol/L NaOH
[0033]平衡和上样：接上装好Capto MMC层析，设报警压力0.3MPa。先用5CV(柱体积)纯化水冲洗层析柱，然后用平衡缓冲液A平衡3
‑
5CV后上发酵液上清。控制发酵液的上样量，使填料的上样载量不超过50mg/mL，上样保留时间不少于5分钟。
[0034]再平衡和洗脱：上完样后，用平衡缓冲液A再平衡3
‑
5CV，接着用3
‑
5CV 100％洗脱缓冲液B洗脱，收集洗脱峰，当UV280nm吸收达到100mAU时收集洗脱峰，当UV280nm吸收降至150mAU时停止收集，中间体记为MF2。洗脱完毕，重复上述操作至所有发酵液中间体上样洗脱完成。
[0035]做完最后一个循环，用清洁缓冲液：0.5mol/L NaOH清洁层析柱及层析系统。
[0036]步骤b)和步骤c)还可以包括样品低pH孵育，灭活病毒，具体为：
[0037]用1mol/L柠檬酸将Capto MMC收集的样品pH调至3.5
±
0.1，测定样品电导确定电导＜5mS/cm，如电导超过限值则用纯化水调节至允许范围，室温放置1小时以上。然后用2mol/L Tris
‑
HCl pH 9.5将pH调至7.0
±
0.1，该步骤中间体记为LPH。
[0038]步骤c)再次层析分离抗体以对抗体进行精细纯化，包括疏水层析和阳离子交换层析两步法。PHE(Phenyl)疏水层析，具体为：
[0039]平衡缓冲液A：20mmol/L PB+1.1mol/L(NH)4SO4，pH7.0<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗体的纯化方法，包括以下步骤：a)细胞发酵液沉淀；b)复合模式层析以捕获抗体；c)再次层析分离抗体以对抗体进行精细纯化；其中，步骤a)中的发酵液以酸性溶液调节发酵pH至设定值，静置30
‑
60分钟后离心获得含抗体粗品的上清液，所得发酵液电导率不超过20mS/cm；将步骤(a)中获得的发酵液加载到步骤b)的预处理好的复合模式层析填料上，用平衡缓冲液清洗复合模式层析填料、用洗脱缓冲液洗脱并收集洗脱液；步骤c)中再次层析分离抗体的方式包括亲和层析、疏水层析或阳离子交换层析中的至少一种。2.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，步骤a)的调节pH的酸性溶液包括冰乙酸、盐酸、柠檬酸中的至少一种，优选柠檬酸。3.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，所述酸性溶液的浓度为2mol/L，调节发酵pH至4
‑
5，优选4.5
±
0.2。4.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，步骤a)的静置时间为45分钟。5.根据权利要求1所述的抗体的纯化方法，其特征在于，步骤b)复合模式层析填料为Capto MMC；平衡缓冲液含有浓度为50mmol/L的NaAC
‑
HAC溶液，pH为4.5
‑
5.5，优选PH为5.5；洗脱缓冲液含有浓度为200mmol/L的Tris
‑
HCl和浓度为1mol/L的NaCl溶液，pH为8...

【专利技术属性】
技术研发人员：任杰，付珍珍，钱子俊，吴伶俐，董振涛，竺松，梅菲，谭小钉，
申请(专利权)人：江苏迈威康新药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：