复合培养基及其应用制造技术

本发明专利技术公开了复合培养基及其应用，其中，该复合培养基包括：基础培养基；流加培养基；以及氨基酸添加剂，所述氨基酸添加剂包括：900

【技术实现步骤摘要】
复合培养基及其应用


[0001]本专利技术设计生物
，具体地，涉及复合培养基和利用该复合培养基培养细胞的方法。

技术介绍

[0002]近年以酶、抗体和细胞因子为基础的产品受到广泛的研究和关注。全世界对蛋白质治疗药物的需求逐年增加。治疗性单克隆抗体(mAbs，monoclonal antibodies)在蛋白质治疗药物中是重要一类。中国仓鼠卵巢细胞
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CHO细胞目前被广泛用于生产单克隆抗体产品。
[0003]市售可得的可用于大规模CHO细胞培养的培养基在使用过程中存在着细胞密度和蛋白表达量低等问题。因此，有必要开发一种用于高表达单克隆抗体的细胞培养基，以便最大限度地提高生产效率，降低生产成本。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种复合培养基，通过氨基酸添加剂改善细胞生长和表达，调节表达抗体的电荷异构体比例，改善细胞生长，提高活细胞密度，增加抗体的表达量。
[0005]需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列工作而完成的：
[0006]单克隆抗体电荷异质体是由于抗体分子生产过程中翻译后修饰及降解导致的等电点或空间电荷分布等表面电荷特性发生了改变，进而导致电荷变体的生成。电荷异构体是单克隆抗体一项重要的质量属性，电荷异构体可影响药物的生物学活性、药物结合能力、体内代谢及免疫原性等方面。
[0007]在细胞培养工艺开发过程中，电荷异构体比例可通过过程参数控制进行调节，如温度、pH等，通过这些参数的调节可有效改善细胞的生长、代谢、产物的表达量以及质量；金属离子是哺乳动物细胞培养基中一类重要的添加剂，可通过调节相关酶的酶活，进而影响电荷变体的生成过程。本文所述单克隆抗体为重组全人源IgG2型抗体，通过构建的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行培养表达，其电荷异构体可分为酸性、中性和碱性组分，可通过离子交换色谱高效液相法(IEC
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HPLC)进行检测，专利技术人通过培养过程中流加一组氨基酸添加剂改善细胞生长、表达，调节表达抗体的电荷异构体比例。
[0008]因而，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种复合培养基。根据本专利技术的实施例，该复合培养基包括：基础培养基；流加培养基；以及氨基酸添加剂，所述氨基酸添加剂包括：900
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1000μM天冬氨酸；800
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850μM丝氨酸；80
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120μM脯氨酸。
[0009]根据本专利技术实施例的复合培养基，基础培养基主要成分为糖、氨基酸、维生素、脂类、微量元素等，这些营养成分是细胞生长和抗体生成的物质基础。单克隆抗体电荷异构体是由于抗体分子生产过程中翻译后修饰导致的抗体表面电荷特性发生了改变，进而导致电荷变体的生成，氨基酸的添加有效调节细胞代谢，改善抗体分子翻译后修饰比例，例如，天
冬酰胺有利于去酰胺化、脯氨酸有利于酰胺化从而，改善细胞生长和表达，调节表达抗体的电荷异构体比例，改善细胞生长，提高活细胞密度，增加抗体的表达量。
[0010]另外，根据本专利技术上述实施例的复合培养基还可以具有如下附加的技术特征：
[0011]根据本专利技术的实施例，所述氨基酸添加剂还包括：35
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50μM蛋氨酸；100
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150μM赖氨酸；50
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75μM组氨酸；400
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500μM精氨酸；380
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420μM苏氨酸；180
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220μM谷氨酰胺；350
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400μM胱氨酸。由此，氨基酸的添加的种类更丰富，补充了细胞培养中氨基酸的损耗，更有效地调节细胞代谢，明显改善抗体分子翻译后修饰比例，冬酰胺有利于去酰胺化、脯氨酸有利于酰胺化，如天冬酰胺有利于去酰胺化焦谷氨酸环化、C端赖氨酸切除、等。
[0012]根据本专利技术的实施例，所述基础培养基为CD CHO培养基，所述流加培养基为Feed C培养基。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述氨基酸添加剂包括：950
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960μM天冬氨酸；810
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820μM丝氨酸；80
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120μM脯氨酸；40
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45μM蛋氨酸；120
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130μM赖氨酸；60
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70μM组氨酸；450
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460μM精氨酸；380
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420μM苏氨酸；180
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220μM谷氨酰胺；380
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395μM胱氨酸。由此，该氨基酸添加剂显著提高培养过程细胞生长密度及抗体表达量，同时可有效调节表达抗体的电荷异构体比例，在保证主峰比例一致的情况下有效提高酸性异构体比例，降低碱性异构体比例。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述天冬氨酸为958.2μM；所述丝氨酸为812.7μM；所述脯氨酸为95.6μM。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述蛋氨酸为42.6μM；所述赖氨酸为123.8μM；所述组氨酸为65.3μM；所述精氨酸为452.7μM；所述苏氨酸为402.2μM；所述谷氨酰胺为199.7μM；所述胱氨酸为389.9μM。
[0016]根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种利用前述的复合培养基培养细胞的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：利用基础培养基对细胞进行第一培养，并定期添加流加培养基；以及在所述第一培养后，流加氨基酸添加剂，进行第二培养。
[0017]专利技术人发现，利用本专利技术实施例的复合培养基培养细胞，能显著改善细胞生长，提高活细胞密度，增加抗体的表达量。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述定期添加为在所述第一培养后的第三天、第六天和第九天流加添加，且所述流加培养基添加量为所述基础培养基的体积的10％。其中，第三天、第六天和第九天是以开始第一培养的当天记为第一天，以此类推，开始第一培养的第二天记为第二天记为第二天，第三天、第六天和第九天分别为开始第一培养的第三天、第六天和第九天。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述第二培养在所述第一培养开始后的第四天开始进行，且所述氨基酸添加剂添加量为所述基础培养基的体积的1％。其中，第一培养开始后的第四天开始是以开始第一培养的当天记为第一天计算的，也就是说在第一培养的第四天，开始添加氨基酸添加剂，添加的方式为流加。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述细胞为重组表达人源化单克隆抗体的哺乳动物细胞。根据本专利技术的优选实施例，所述细胞为重组表达人源化单克隆抗体的中国仓鼠卵巢细胞。根据本专利技术的一些具体实施例，该细胞为重组表达人源化单克隆抗体的CHO、HEK293、NS0、BHK等。其中，需要说明的是，该复合培养基不限于用于重组表达人源化单克隆抗体的哺乳动物细胞，也可以用于普通的非重组的哺乳动物细胞的培养。
[0021]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种复合培养基，其特征在于，包括：基础培养基；流加培养基；以及氨基酸添加剂，所述氨基酸添加剂包括：900
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1000μM天冬氨酸；800
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850μM丝氨酸；80
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120μM脯氨酸。2.根据权利要求1所述的复合培养基，其特征在于，所述氨基酸添加剂还包括：35
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50μM蛋氨酸；100
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150μM赖氨酸；50
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75μM组氨酸；400
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500μM精氨酸；380
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420μM苏氨酸；180
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220μM谷氨酰胺；350
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400μM胱氨酸。3.根据权利要求1所述的复合培养基，其特征在于，所述基础培养基为CD CHO培养基，所述流加培养基为Feed C培养基。4.根据权利要求2所述的复合培养基，其特征在于，所述氨基酸添加剂包括：950
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960μM天冬氨酸；810
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820μM丝氨酸；80
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120μM脯氨酸；40
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45μM蛋氨酸；120
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130μM赖氨酸；60
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70μM组氨酸；450
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【专利技术属性】
技术研发人员：殷龙，贾艳丽，姚月琴，谭小钉，
申请(专利权)人：江苏迈威康新药研发有限公司，
类型：发明
国别省市：