多聚体在CAR表达细胞检测和细胞制备中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种多聚体在CAR表达细胞检测和细胞制备中的应用。抗原多聚体能够实现高度特异、灵敏和精确的CAR检测，可通过磁性富集用于敏感检测罕有的CAR

【技术实现步骤摘要】
多聚体在CAR表达细胞检测和细胞制备中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体指一种多聚体在CAR表达细胞检测和细胞制备中的应用。

技术介绍

[0002]CAR
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T(Chimeric Antigen Receptor T
‑
Cell Immunotherapy)是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的非常具有前景的肿瘤免疫治疗方法。
[0003]T细胞也叫T淋巴细胞，技术人员通过基因工程技术，将T细胞激活，将CAR(肿瘤嵌合抗原受体)转导入T淋巴细胞，获得CAR
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T细胞，它利用其CAR的特性，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，它们能高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。
[0004]随着CAR
‑
T疗法的发展，需要特异性高、敏感性好、精确度佳和多功能的CAR染色试剂来进行生化分析、进行临床前研究、分析患者生物样本以及开发新的CAR。然而，现有的CAR染色试剂均存在局限性。结合CAR单链抗体的通用CAR染色试剂(多克隆抗IgG抗体和蛋白L)受到非特异性结合、与其他抗体不相容的限制，以及对多步骤染色程序的要求。虽然某些特定的CAR染色试剂(目标抗原和抗独特型抗体)可以在市场上买到，但通常受到蛋白质稳定性和高开发成本的限制。此外，所有现有的CAR染色试剂因结合价≤2而应用受限。因此开发具有更高亲和力的，更优检测性能的CAR染色试剂，具有重要的应用前景。
[0005]现有中国专利公开了“一种多聚体结合试剂”(公开号CN107847544A)，有望解决上述问题，填补这一领域的应用空缺。
[0006]此外，现有技术路线在制备CAR
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T细胞时，常采用抗CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激从病人外周血提取的T细胞后，加入慢病毒对T细胞转染以表达抗CD19的CAR，再继续利用抗CD3/CD28抗体偶联磁珠来刺激扩增生产CAR
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T细胞。除了磁珠毒性的问题，该方法存还在非特异性细胞增殖的缺陷。这是由于CAR
‑
T细胞慢病毒转染效率较低，仅有部分T细胞在转染后表达CAR分子，而抗CD3/CD28抗体偶联磁珠会刺激所有T细胞，无差别地扩增表达和不表达CAR的细胞群体，导致目前生产的CAR
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T细胞产品纯度比较低。现有正常情况下，仅有少部份(～30％)获得的细胞是CAR
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T细胞，而大部分细胞(～70％)是非CAR
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T细胞，如图11B所示。此技术缺点极大地影响和限制了CAR
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T细胞的临床治疗效果，是目前CAR
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T细胞生产的一大主要亟待解决的问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服上述CAR
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T应用技术中存在的问题，提供一种多聚体在CAR表达细胞制备和检测中的应用。这里CAR表达细胞可以是CAR
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T细胞、CAR
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NK细胞、CAR巨噬细胞或其他CAR转导细胞。
[0008]本专利技术首先提供了一种CAR染色试剂，它包含多聚体
‑
抗原分子的结合物，所述抗
原分子是生物素标记的对待检测的CAR具有特异性结合力的抗原分子；
[0009]所述多聚体包含：
[0010]1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:3；
[0011]2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，所述链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原分子；所述链霉亲和素上有可检测的标记物。
[0012]需要说明的是，上述CAR染色试剂中所述多聚体及其蛋白亚基的序列中的SEQ ID NO:1与中国专利“一种多聚体结合试剂”(公开号CN107847544A)中公开的一致。即本申请揭示了其可以作为CAR染色试剂的用途。
[0013]优选地，所述待检测的CAR具有低亲和力特性。
[0014]优选地，所述待检测的CAR的K
D
值≥0.1nM。
[0015]可选地，所述待检测的CAR为CD19的CAR。
[0016]可选地，所述待检测的CAR由针对同一种抗原分子的多种CAR的混合组成。
[0017]优选地，所述CAR染色试剂的工作温度为0～25℃，更有选为4℃。
[0018]其次，本专利技术提供了一种CAR表达细胞特异扩增生产试剂，包含抗原与多聚体的结合物；
[0019]所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子；
[0020]所述多聚体包含：
[0021]1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:1；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:2；
[0022]2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，所述链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。
[0023]需要说明的是，上述多聚体应理解为包含五聚体、八聚体、十二聚体、甚至二十聚体等多个由数量不等的支架蛋白和链霉亲和素的结合物，一个支架蛋白可以结合不同数量的链霉亲和素，而四个链霉亲和素又可以结合1个以上的支架蛋白，由此排列组合可以得到不同形式的多聚体。本申请不仅公开了十二聚体可以作为生产试剂进行CAR表达细胞特异性扩增的用途，还揭示了其他多聚体同样能有此用途，仅存在效果优劣的差异。
[0024]优选地，所述试剂的使用温度为30～40℃，优选37℃。
[0025]可选地，所述多聚体为十二聚体。
[0026]另一种本专利技术提供的CAR表达细胞特异扩增生产试剂，包括一个链霉亲和素，所述链霉亲和素通过生物素结合2～4个抗原，所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子，将该CAR表达细胞特异扩增生产试剂命名为抗原链霉四聚体。其使用温度同样为30～40℃，优选37℃。
[0027]本专利技术还提供了上述CAR表达细胞特异扩增生产试剂在CAR
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T细胞制备过程中的
应用。
[0028]具体还提供了一种CAR
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T细胞特异扩增培养方法，包括如下步骤：将前述的CAR表达细胞特异扩增生产试剂加入到在培养的CAR
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T细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CAR染色试剂，其特征在于：它包含多聚体
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抗原分子的结合物，所述抗原分子是生物素标记的对待检测的CAR具有特异性结合力的抗原分子；所述多聚体包含：1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:3；2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，所述链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原分子；所述链霉亲和素上有可检测的标记物。2.根据权利要求1所述的CAR染色试剂，其特征在于：所述待检测的CAR具有低亲和力特性。3.根据权利要求2所述的CAR染色试剂，其特征在于：所述待检测的CAR的K
D
值≥0.1nM。4.根据权利要求1所述的CAR染色试剂，其特征在于：所述待检测的CAR为抗CD19的CAR，抗HER2的CAR或抗糖苷的CAR。5.根据权利要求1所述的CAR染色试剂，其特征在于：所述待检测的CAR由针对同一种抗原分子的多种CAR的混合组成。6.一种CAR表达细胞特异扩增生产试剂，其特征在于：所述试剂包含抗原与多聚体的结合物；所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子；所述多聚体包含：1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:3；2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。7.根据权利要求6所述的CAR表达细胞特异扩增生产试剂，其特征在于：所述多聚体为十二聚体。8.根据权利要求6所述的CAR表达细胞特异扩增生产试剂，其特征在于：所述试剂的使用温度为30～40℃。9.一种CAR表达细胞特异扩增生产试剂，其特征在于：所述试剂包括一个链霉亲和素，所述链霉亲和素通过生物素结合2～4个抗原，所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子。10.一种CAR
‑
T细胞特异扩增培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求6～9任一项所述的CAR表达细胞特异扩增生产试剂加入到在培养的CAR
‑
T细胞群体中，使培养所生产的CAR
‑
T细胞达到预设的治疗标准。11.一种CAR表达检测试剂，其特征在于：包含用寡核苷酸标记的抗原多聚体，所述抗原
多聚体为抗原与多聚体的结合物；所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子；所述多聚体包含：1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:3；2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。12.根据权利要求11所述的CAR表达检测试剂，其特征在于：所述多聚体为十二聚体。13.一种CAR表达检测试剂，其特征在于：包含未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素通过生物素结合2～4个抗原，所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子。14.一种CAR表达检测方法，其特征在于，包括步骤：利用权利要求11～13任一项所述CAR表达检测试剂染色CAR，再通过单细胞测序进行CAR表达检测。15.一种定点生物素标记分子，是位于抗原蛋白的序列中，使所述抗原蛋白可被生物素化的标记分子，其氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊，胡逸飞，
申请(专利权)人：黄俊，
类型：发明
国别省市：