一种PINP单克隆抗体、含有其的试剂盒及其应用制造技术

一种PINP单克隆抗体、含有其的试剂盒及其应用，该抗体通过如下方法制备获得：先通过合成基因并构建载体后在大肠杆菌中诱导表达PINP蛋白P1、P2和P3并进行纯化，获得重组抗原P1、P2和P3；将重组抗原P2和P3对动物进行免疫，获得免疫细胞；将所述免疫细胞和融合伴侣细胞融合，并且挑选出阳性融合细胞；对所述阳性融合细胞进行亚克隆得到克隆化的融合细胞，所述克隆化的融合细胞分泌单克隆抗体；其中，所述抗原为重组抗原P1、P2和P3，所述重组抗原P1、P2和P3分别对应PINP序列中23

【技术实现步骤摘要】
一种PINP单克隆抗体、含有其的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及化学发光免疫诊断
，特别是涉及一种PINP（Ⅰ型前胶原氨基端原肽）单克隆抗体、含有其的试剂盒及其在检测人血清PINP中的应用。

技术介绍

[0002]骨骼Ⅰ型胶原约占骨质的 90%，是人体最丰富的胶原蛋白形式。I 型胶原主要在骨组织中合成，首先是原胶原形式，此时在 I 型原胶原的氨基 N 端和 C 端各有一个延长肽，分别被称为 I 型原胶原 N 端前肽（PINP）和 I 型原胶原 C 端前肽（PICP）；当 I 型原胶原被成骨细胞分泌到细胞外时，N 端和 C 端的延长肽会被蛋白酶切割，少量沉积在骨基质中，而大部分则会进入血液循环，最终被肝脏代谢清除。血液中的PINP为三聚体形式(由三聚体胶原转化而来)，但在热降解作用下会很快成为单体形式。PINP试剂检测的是血液中所有的PINP形式，因此称为总PINP（tPINP）。
[0003]在排除肝脏疾病的影响下，检测血液中的PINP 含量能够确切的反应成骨细胞的活性，进而反应体内骨代谢的强度，指导骨代谢异常引起疾病的诊断和治疗。此外，PINP也可用于佩吉特骨病(Paget
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s bone disease)、成骨细胞转移瘤、乳腺癌，前列腺癌和儿童青少年的生长过程监测。PINP检测目前分为全段PINP(Intact)和总PINP(Intact+Monomer)两种，除了在检测肾功能障碍病人时，全段PINP的结果更加准确外，其他情况下两者的相关性还是较好的。
[0004]I型前胶原氨基末端肽检测方法多采用免疫学方法。目前我国批准上市的I型前胶原氨基末端肽检测试剂多为进口，采用的检测方法学多为酶免检测法和化学发光检测法。酶免检测法在检测灵敏度、检测线性范围等方面远不及化学发光检测法。此外化学发光检测法还具有底物危害小、有效期长、干扰因素少、自动化程度高等优势。但无论是酶免还是化学发光检测法，它们都建立在抗原与抗体特异性结合的基础上，因此特异性的抗体对是这些检测方法的核心原料。
[0005]然而，目前市面上的抗体原料存在各种不足，很难找到合适的抗体配对。多肽作为免疫原制备的单克隆抗体虽然特异性较好，但由于抗原位点单一，无法满足不同方法学的需求。同时，多肽序列与天然蛋白结构的相似度有一定的差异，因此所获得单克隆抗体与天然蛋白的结合力也会较差，进而会影响检测试剂的灵敏度。此外，多克隆抗体的批间差控制也是目前在开发体外诊断试剂中的一大难题。

技术实现思路

[0006]本申请针对现有技术的上述不足，提供一种能有效提高PINP的检测效率和灵敏度，批间差容易控制的PINP单克隆抗体。
[0007]为了解决上述技术问题，本申请采用的技术方案为：一种PINP单克隆抗体，该抗体通过如下方法制备获得，制备过程包括：先通过合成基因并构建载体后在大肠杆菌中诱导表达PINP蛋白P1、P2和P3并进行纯化，获得重组抗原P1、P2和P3；将重组抗原P2和P3对动物
进行免疫，获得免疫细胞；将所述免疫细胞和融合伴侣细胞融合，并且挑选出阳性融合细胞；对所述阳性融合细胞进行亚克隆得到克隆化的融合细胞，所述克隆化的融合细胞分泌单克隆抗体；其中，所述抗原为重组抗原P1、P2和P3，所述重组抗原P1、P2和P3分别对应PINP序列中23
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161aa、23
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96aa和97
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161aa基因序列；所述单克隆抗体为P1、P2和P3来源的单抗。
[0008]进一步地，所述的P1、P2和P3对应的氨基酸序列如下：P1:QEEGQVEGQDEDIPPITCVQNGLRYHDRDVWKPEPCRICVCDNGKVLCDDVICDETKNCPGAEVPEGECCPVCPDGSESPTDQETTGVEGPKGDTGPRGPRGPAGPPGRDGIPGQPGLPGPPGPPGPPGPPGLGGNFAP；P2:QEEGQVEGQDEDIPPITCVQNGLRYHDRDVWKPEPCRICVCDNGKVLCDDVICDETKNCPGAEVPEGECCPVCPP3:DGSESPTDQETTGVEGPKGDTGPRGPRGPAGPPGRDGIPGQPGLPGPPGPPGPPGPPGLGGNFAP。
[0009]进一步地，所述重组抗原的制备包括：将所述23
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161aa、23
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161aa基因序列均分别采用BamH1、Xho1双酶切；将双酶切后的23
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161aa、23
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161aa基因序列分别与采用相同酶切方式酶切的pet28a质粒连接，并转化至大肠杆菌感受态细胞，表达纯化得到所述重组抗原P1、P2和P3。
[0010]进一步地，所述阳性融合细胞通过间接Elisa法挑选得到。
[0011]进一步地，所述的抗体的制备方法还包括以下步骤：在捕获抗体中加入重组抗原P1，进行免疫反应，清洗后加入标记抗体，清洗后加入SA
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HRP（辣根过氧化物酶标记Streptavidin也称辣根过氧化物酶标记链霉亲和素），显色则配对成功。
[0012]本申请还提供一种tPINP体外诊断试剂盒，所述的试剂盒包括发光试剂、固相试剂、校准品和质控品。
[0013]进一步地，所述固相试剂的制备原料包括磁微粒，所述的磁微粒为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，在所述磁微粒表面含有一种或多种活性功能基团。
[0014]进一步地，所述的固相试剂为PINP单克隆抗体包被的磁微粒混悬液，磁微粒的浓度为0.1~1mg/ml，固相试剂中还包含游离的PINP单克隆抗体、其浓度为50~1000ng/ml。
[0015]进一步地，所述发光试剂为含吖啶酯按比例标记的PINP单克隆抗体的工作液，浓度为0.1~1.0μg/ml。
[0016]本专利技术还提供了一种tPINP体外诊断试剂盒的制备方法，包括以下步骤：制备固相试剂稀释液：将缓冲液、无机盐、金属螯合剂、蛋白保护剂、防腐剂、表面活性剂依次溶解到纯化水中，调节pH至6.0~8.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；制备发光试剂稀释液：将缓冲液、无机盐、金属螯合剂、蛋白保护剂、防腐剂、表面活性剂依次溶解到纯化水中，调节pH至5.0~7.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；制备校准品稀释液：将缓冲液、无机盐、金属螯合剂、蛋白保护剂、防腐剂、表面活性剂依次溶解到纯化水中，调节pH至6.0~8.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；制备校准品：将PINP重组抗原按照比例添加到校准品稀释液中，配制成浓度分别为100ng/ml、800ng/ml的校准品溶液，分别记为CAL1、CAL2；
制备质控品：将PINP抗原重组抗原按照比例添加到校准品稀释液中，配制成浓度分别为60n本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PINP单克隆抗体，其特征在于：该抗体通过如下方法制备获得，制备过程包括：先通过合成基因并构建载体后在大肠杆菌中诱导表达PINP蛋白P1、P2和P3并进行纯化，获得重组抗原P1、P2和P3；将重组抗原P2和P3对动物进行免疫，获得免疫细胞；将所述免疫细胞和融合伴侣细胞融合，并且挑选出阳性融合细胞；对所述阳性融合细胞进行亚克隆得到克隆化的融合细胞，所述克隆化的融合细胞分泌单克隆抗体；其中，所述抗原为重组抗原P1、P2和P3，所述重组抗原P1、P2和P3分别对应PINP序列中23
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161aa、23
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161aa基因序列；所述单克隆抗体为P1、P2和P3来源的单抗。2.根据权利要求1所述PINP单克隆抗体，其特征在于：P1:QEEGQVEGQDEDIPPITCVQNGLRYHDRDVWKPEPCRICVCDNGKVLCDDVICDETKNCPGAEVPEGECCPVCPDGSESPTDQETTGVEGPKGDTGPRGPRGPAGPPGRDGIPGQPGLPGPPGPPGPPGPPGLGGNFAP；P2:QEEGQVEGQDEDIPPITCVQNGLRYHDRDVWKPEPCRICVCDNGKVLCDDVICDETKNCPGAEVPEGECCPVCP；P3:DGSESPTDQETTGVEGPKGDTGPRGPRGPAGPPGRDGIPGQPGLPGPPGPPGPPGPPGLGGNFAP。3.根据权利要求1所述PINP单克隆抗体，其特征在于：所述抗原的制备过程包括：将所述23
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161aa、23
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161aa基因序列均分别采用BamH1、Xho1双酶切；将双酶切后的所述23
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161aa、23
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96aa和97
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161aa基因序列分别与采用相同酶切方式酶切的pet28a质粒连接，并转化至大肠杆菌感受态细胞，表达纯化得到所述重组抗原P1、P2和P3；所述阳性融合细胞通过间接Elisa法挑选得到。4.根据权利要求1
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3中任一项PINP单克隆抗体，其特征在于：还包括以下步骤：在捕获抗体中加入重组抗原P1、P2或P3，进行免疫反应，清洗后加入标记抗体，清洗后加入SA
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HRP，显色则配对成功。5.一种tPINP体外诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括发光试剂、固相试剂、校准品和质控品。6.根据权利要求5所述的tPINP体外诊断试剂盒，其特征在于：所述固相试剂的制备原料包括磁微粒，所述的磁微粒为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，在所述磁微粒表面含有一种或多种活性功能基团。7.根据权利要求6所述的tPINP体外诊断试剂盒，其特征在于：所述固相试剂为PINP单克隆抗体包被的磁微粒混悬液，磁微粒浓度为0.1~1mg/ml，其中还包含游离的PINP单克隆抗体，浓度为50~1000ng/ml；所述发光试剂为含吖啶酯按一定比例标记的PINP单克隆抗体的工作液，浓度为100~500ng/ml。8.一种tPINP体外诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤包括：制备固相试剂稀释液：将缓冲液、无机盐、金属螯合剂、蛋白保护剂、防腐剂、表面活性剂依次溶解到纯化水中，调节pH至6.0~8.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；制备发光试剂稀释液：将缓冲液、无机盐、金属螯合剂、蛋白保护剂、防腐剂、表面活性剂依次溶解到纯化水中，调节pH至5.0~7.0范围内，按照配制量进行定容，经0.22μm滤膜过滤后备用；制备校准品稀释液：将缓冲液、无机盐、金属螯合剂、蛋白保护剂、防腐剂、表面活性剂依次溶解到纯化水...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹继华，潘碧莹，贾江花，李富勇，张华杰，柴银皎，姜敏杰，张明宇，李倩靓，
申请(专利权)人：美康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：