【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外诊断，具体而言，涉及一种3α-羟基类固醇脱氢酶、基因、试剂盒、表达载体。
技术介绍
1、胆汁酸是胆汁的主要有机成分，是几种结构类似的类固醇酸的统称，其主要的代谢过程是由肝脏完成的。早期胆汁酸的测定方法主要为气相色谱法、高效液相色谱法，但由于这些方法测定步骤繁琐、测定时间长，所需大量血清样本，使临床应用受到限制。现代临床研究表明，血液胆汁酸的浓度变化可以有效检测肝细胞是否发生病变，肝功能是否有损伤。因此，开发一种步骤简便，测定时间短的胆汁酸检测方法尤为重要。
2、近年来，临床开发了酶法检测胆汁酸试剂。酶法检测由于操作简单、灵敏度高、成本低，且结合全自动生化仪的使用，可快速进行常规检查。酶法检测的原理为：胆汁酸被3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-hydroxysteroiddehydrogenase，3α-hsd)及thio-nad+特异性氧化，生成3-酮类固醇及thio-nadh，3-酮类固醇继续在3α-hsd及nadh存在下，生成胆汁酸和nad+，如上述，循环往复从而放大微量的总胆汁酸含量，测定生成的thio-nadh的吸光度变化，以求得胆汁酸浓度。
3、存在的问题是：3α-hsd作为总胆汁酸检测试剂中的关键原料，目前主要来源于睾酮假单胞菌提取或基因工程表达，但提取纯化步骤繁琐，得率低，生产成本偏高；而基因工程表达的野生型3α-hsd催化活性低，热稳定性不佳，导致试剂盒灵敏度偏低，在运输和使用过程中稳定性不好。综上所述，经提取纯化或通过基因工程表达以后得到的3α-hsd酶活性不高，使得酶法检
技术实现思路
1、本专利技术解决了目前经提取纯化或通过基因工程表达以后得到的3α-hsd酶活性不高，使得酶法检测胆汁酸过程中催化效率较低的技术问题，实现了提高3α-hsd催化活性，进而提高检测效率的技术效果。
2、为解决上述问题，本专利技术提供一种3α-羟基类固醇脱氢酶，3α-羟基类固醇脱氢酶在野生型的假单胞菌属的3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的59位、85位、135位以及233位进行了替换修饰，分别替换修饰为c59y、v85l、d135e、s233r，氨基酸序列如seq id no.1所示。
3、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术以假单胞菌属的野生型3α-hsd基因序列为模板，进行易错pcr随机突变，构建3α-hsd突变文库，通过特异性酶切，将突变文库片段连接到pet-22b质粒中，转化到e.coli bl21(de32)中，经平板初筛和摇瓶复筛确定，获得活性和热稳定性最佳的3α-hsd及其重组表达菌株，该3α-hsd的氨基酸序列如seq id.no.1所示，在该酶的序列上有4个突变氨基酸，分别为c59y、v85l、d135e、s233r。本专利技术获得的3α-羟基类固醇脱氢酶活性和热稳定性均得以提高，催化雄酮脱氢反应的比酶活为130u/mg，60℃处理30min后，酶活保留率可达72.3％。而且该酶可以通过e.coli基因工程菌进行重组表达，工程菌培养方式简单、表达量高、纯化简单、回收率高，使得该酶生产成本低，可以实现快速大量生产。
4、本专利技术还提供一种基因，基因的核苷酸序列编码上述实例的3α-羟基类固醇脱氢酶，核苷酸序列如seq id no.2所示或为对seq id no.2所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。
5、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：经过dna测序反应，该酶核苷酸编码序列如seq id no.2所示，与原有基因序列相比，有6处核苷酸序列发生突变，分别是176位g→a，253位g→c，405位t→a，456位t→a，540位g→c，699c→g，其中456位、540位为同义碱基突变，未导致编码的氨基酸发生改变。本专利技术提供的基因具有上述3α-羟基类固醇脱氢酶的所有有益效果，在此不再赘述。
6、本专利技术还提供一种用于体外总胆汁酸含量检测的试剂盒，包含上述实例的3α-羟基类固醇脱氢酶。
7、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术提供的3α-羟基类固醇脱氢酶可以应用于体外总胆汁酸检测试剂盒中，该试剂盒用于总胆汁酸检测不仅准确度、精密度、线性范围良好，而且由于酶催化活性高，可以减少酶用量，降低试剂成本；酶稳定性提高，可以改善试剂盒稳定性。在37℃热储加速11天和4℃放置18个月，试剂盒性能指标均表现良好。
8、本专利技术还提供一种催化剂，其有效成分包含上述实例的3α-羟基类固醇脱氢酶。
9、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术提供的催化剂具有上述3α-羟基类固醇脱氢酶的所有有益效果，在此不再赘述。
10、本专利技术还提供一种表达载体，含有上述实例的基因。
11、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术提供的表达载体具有上述基因的所有有益效果，在此不再赘述。
12、本专利技术还提供一种重组菌，重组菌被上述实例的表达载体转化，经表达载体转化的重组菌选自大肠杆菌。
13、与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术提供的重组菌具有上述表达载体的所有有益效果，在此不再赘述。
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1.一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其特征在于，所述3α-羟基类固醇脱氢酶在野生型的假单胞菌属的3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的59位、85位、135位以及233位进行了替换修饰，分别替换修饰为C59Y、V85L、D135E、S233R，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列编码如权利要求1所述的3α-羟基类固醇脱氢酶，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或为对SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行一个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。
3.一种用于体外总胆汁酸含量检测的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的3α-羟基类固醇脱氢酶。
4.一种催化剂，其特征在于，其有效成分包含如权利要求1所述的3α-羟基类固醇脱氢酶。
5.一种表达载体，其特征在于，含有如权利要求2所述的基因。
6.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌被如权利要求5所述的表达载体转化，经所述表达载体转化的重组菌选自大肠杆菌。
【技术特征摘要】
1.一种3α-羟基类固醇脱氢酶，其特征在于，所述3α-羟基类固醇脱氢酶在野生型的假单胞菌属的3α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的59位、85位、135位以及233位进行了替换修饰，分别替换修饰为c59y、v85l、d135e、s233r，氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列编码如权利要求1所述的3α-羟基类固醇脱氢酶，所述核苷酸序列如seq id no.2所示或为对seq id no.2所示的核苷酸序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹继华，章玉胜，贾江花，张帅，陈义，李王宗，赵红彦，
申请(专利权)人：美康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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