一种生产亚精胺的工程菌制造技术

本发明专利技术公开了一种生产亚精胺的工程菌，属于遗传工程领域。本发明专利技术采用代谢工程改造的方法，解除亚精胺合成途径的各种产物抑制、改变亚精胺转运系统、强化关键通路的酶活性、并引入外源途径，获得了一株高产亚精胺的大肠杆菌工程菌。具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种生产亚精胺的工程菌
本专利技术涉及一种生产亚精胺的工程，属于生物工程

技术介绍
亚精胺(Spermidine)，线性分子式为NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2，广泛存在于微生物、植物和动物体内，是一种重要的生理活性物质。亚精胺具有延长动物寿命的功效，并抵消与年龄相关的疾病，如心血管疾病，神经退行性疾病和癌症等。如图1所示，生物体中主要有两条途径合成亚精胺：(1)经由羧基化腺苷甲硫氨酸和腐胺在亚精胺合成酶的作用下直接合成亚精胺，羧基化腺苷甲硫氨酸可由甲硫氨酸(Met)，经过相关酶的腺苷化和脱羧化催化得到，该途径在动物、植物和微生物体内，是比较常见的传统亚精胺合成的途径；(2)经由天冬氨酸-β-半醛和腐胺在羧基亚精胺脱氢酶和脱羧酶的催化下合成亚精胺，天冬氨酸-β-半醛可经常见氨基酸如天冬氨酸(Asp)经相关酶的磷酸化和脱氢化催化合成，该途径为新发现的替代合成途径，主要存在于一些细菌中，包括重要的人类病原体，肠道菌群等。在大肠杆菌中仅存在途径1。这些途径中的酶受到高度调控，动植物体的亚精胺含量较低，目前也未发现可以大量生产亚精胺的微生物。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是构建一种经改造的大肠杆菌基因工程菌，能够实现亚精胺的高效生产。[技术方案]本专利技术提供了一种大肠杆菌基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，敲除了编码DNA结合转录抑制因子的metJ基因、编码DNA结合双转录调节因子的argR基因，并对编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因进行突变构建负反馈突变体，以解除甲硫氨酸对高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的反馈抑制。更进一步地，本专利技术还利用强启动子替代编码甲硫氨酸腺苷基转移酶的基因metK、编码鸟氨酸脱羧酶的基因speC、编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶和亚精胺合成酶的基因speDE的天然启动子。例如，利用强启动子trc替代metK、speC、speDE的天然启动子，以强化表达甲硫氨酸腺苷基转移酶、鸟氨酸脱羧酶、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶、亚精胺合成酶。更进一步地，本专利技术还敲除了将亚精胺转移到胞内的转运蛋白PotABCD，并强化了将亚精胺转移到胞外的转运蛋白MdtJI的表达。例如，敲除了转运蛋白的ATP结合亚基potA，并利用强启动子trc替代mdtJ、mdtI的天然启动子，以强化表达大肠杆菌将亚精胺转运出细胞的蛋白。更进一步地，本专利技术还进一步敲除了编码二氨基庚酸脱羧酶的lysA基因，或者，在敲除了lysA基因的基础上进一步敲除编码高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶的thrB和thrC基因，或者，在敲除了lysA、thrB和thrC基因的基础上进一步敲除编码吡咯啉-5-羧酸还原酶的proC基因。更进一步地，本专利技术还进一步敲除了编码谷氨酸-腐胺连接酶的puuA基因。更进一步地，本专利技术还进一步引入外源的合成亚精胺的途径。例如，本专利技术还进一步表达了外源的羧基亚精胺脱氢酶基因、外源羧基亚精胺脱羧酶基因。本专利技术提供的基因工程菌可以用于生产亚精胺，尤其是用于高密度培养生产亚精胺。本专利技术的基因工程菌可以选择的宿主包括大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌JM109、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10或大肠杆菌MG1655。构建本专利技术的基因工程菌时，可以利用同源重组原理进行基因的整合表达，敲除基因时可以采用同源重组敲除方法或者Crispr/Cas9敲除方法。[有益效果]本专利技术基于合成生物学方法构建了一种以葡萄糖为原料高产亚精胺的大肠杆菌，生产过程简单且原料易得成本低，具有良好的工业化应用前景。本专利技术解除了反馈抑制和阻遏，如图1所示，甲硫氨酸的合成是从高丝氨酸开始的多级酶联反应，移除甲硫氨酸对metA编码的高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的抑制作用是必须的。MetJ和ArgR则分别为蛋氨酸(Met)和丁二胺(Put)途径的阻遏蛋白。本专利技术解除了甲硫氨酸的反馈抑制，并解除了MetJ和ArgR对途径的阻遏。本专利技术强化了关键酶的表达。speE基因编码的亚精胺合成酶，是Put和Dc-SAM缩合形成亚精胺(Spd)的关键酶，metK编码的蛋氨酸腺苷转移酶则是合成Dc-SAM的关键酶，强化这两个酶的表达，可以提高亚精胺的产量。本专利技术改善了亚精胺的转运途径，PotABCD和MdtJI蛋白分别是亚精胺转运入和转运出细胞的蛋白，将PotABCD敲除，将MdtJI强化表达，可以提高亚精胺的产量。本专利技术弱化了亚精胺过程的竞争途径，在亚精胺合成过程中的天冬半醛中间体有多个氨基酸生成的竞争途径，如Lys、Thr/Iso；谷氨酸中间体也存在竞争途径，如Pro的合成，将这几个途径弱化，可以提高亚精胺的产量。本专利技术敲除相关分解途径，大肠杆菌中存在利用和降解亚精胺合成的中间体和产物的酶，如astC编码的琥珀酰鸟氨酸转氨酶会降解鸟氨酸；speG编码的丁二胺乙酰转移酶会将丁二胺转化为乙酰化的形式，同时还有PuuA介导的丁二胺降解途径。因此，敲除这几个相关的分解途径，可以提高亚精胺的产量。本专利技术引入外源途径，大肠杆菌内传统的亚精胺合成途径，经过羧基化-S-腺苷甲硫氨酸和腐胺在亚精胺合成酶作用下合成亚精胺，羧基化-S-腺苷甲硫氨酸的合成途径较长。因此，引入了外源CASDH/CASDC合成途径，在大肠杆菌中实现亚精胺的双途径合成，可以进一步提高亚精胺的产量。附图说明图1两种现有的合成亚精胺的途径具体实施方式1、本专利技术所涉及的菌株及质粒购自Novagen公司的pRSFDuet-1、pTrc99a、PKD46、pCP20、T19载体质粒，pMD18-T载体质粒、EscherichiacoliBL21(DE3)、EscherichiacoliJM109、EscherichiacoliDH5α、EscherichiacoliTop10、EscherichiacoliMG1655。2、发酵条件本专利技术验证菌株产量时所采用的摇瓶发酵培养基配方为：每升含有10g葡萄糖，10g酵母提取物，20gNaCl，50％(v/v)的R/2培养基，5ml微量金属元素原液；R/2培养基成分为：每升含有2g(NH4)2HPO4、6.75gKH2PO4,、0.85g柠檬酸、0.7gMgSO4·7H2O，.pH6.86；微量金属元素原液成分为：每升含有5MHCl、10gFeSO4·7H2O、2.25gZnSO4·7H2O、1gCuSO4·5H2O、0.5gMnSO4·5H2O、0.23gNa2B4O7·10H2O、2gCaCl2·2H2O、0.1g(NH4)6Mo7O24.。摇瓶发酵控制温度37℃和初始pH为7，装液量为摇瓶体积的1/5，转速控制200rpm，摇瓶发酵时间24小时。3.亚精胺含量的测定方法制备OPA衍生试剂：采用Uren法和Karababa(15)制备OPA试剂。0.20gOPA溶于9.0mL甲醇中，加入1.0mLof0.40M(pH9.0)硼酸盐缓冲液和160μL2-巯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，敲除了大肠杆菌基因组中编码DNA结合转录抑制因子的metJ基因、编码DNA结合双转录调节因子的argR基因，并对编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因进行突变构建负反馈突变体，以解除甲硫氨酸对高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的反馈抑制。/n

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，敲除了大肠杆菌基因组中编码DNA结合转录抑制因子的metJ基因、编码DNA结合双转录调节因子的argR基因，并对编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的metA基因进行突变构建负反馈突变体，以解除甲硫氨酸对高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的反馈抑制。


2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，利用强启动子替代编码甲硫氨酸腺苷基转移酶的基因metK、编码鸟氨酸脱羧酶的基因speC、编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶和亚精胺合成酶的基因speDE的天然启动子。


3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述强启动子是trc启动子。


4.根据权利要求1或2所述的一种大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，还敲除了将亚精胺转移到胞内的转运蛋白PotABCD，并利用强启动子替代编码将亚精胺转移到胞外的转运蛋白MdtJI蛋白的基因的天然启动子。


5.根据权利要求1或2或4任一所述的一种大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，进一步敲除了编码二氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡宇杰，梁鑫鑫，惠红杰，邓华祥，丁彦蕊，白亚军，郑晓晖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32