一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE‑311菌株及其应用，本发明专利技术提供了一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE‑311菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年9月18日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019733，分类学命名Escherichia coli。该菌株具有高转化效率，是作为改造、表达的良好宿主，且自身能表达K99黏附素。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311菌株及其应用
本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311菌株及其应用。
技术介绍
肠毒素性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli)是引起新生仔猪和断奶仔猪黄痢、白痢、水肿等腹泻疾病的主要病原菌之一，给我国乃至全世界养猪业带来了巨大经济损失。ETEC的主要致病因子有两种：黏附素(又称定居因子抗原)和肠毒素。在感染初生仔畜后，ETEC通过黏附素在宿主肠道内迅速定植、繁殖，进而产生肠毒素使动物水和电解质失衡，出现腹泻甚至脱水死亡的情况，发病率和死亡率均很高。定植过程是毒素积累的前提条件，ETEC的致病性很大程度上取决于其定植、增殖的能力。不同的ETEC菌株的菌毛抗原类型不同，主要有K88、K99、F41、987P，引起仔猪腹泻的主要肠毒性大肠杆菌菌株的抗原类型主要是K88和K99。近年来，为了解决由ETEC引起的仔猪腹泻等一系列疾病，国内外学者致力于具有抗体菌株的疫苗研发工作。传统的多黏附素菌株的构建都是扩增多重菌毛基因串联表达，且以常见工程菌作为宿主，常见工程菌自身都不具备K99黏附素基因片段也不能表达K99黏附素，而本专利技术提供了筛选出的一种具有高转化效率的菌株作为改造、表达宿主，且该菌株自身具有K99黏附素并能大量表达外源质粒的基因。本专利技术利用筛选出的菌株所制备重组菌株能够实现肠毒性大肠杆菌特异性菌毛的双重表达，使重组菌株能够同时具备多重黏附蛋白抗原，为多联黏附蛋白抗体提供菌株基础。同时，表达有双黏附素的大肠杆菌细胞壁具有更强的与肠道细胞受体结合的能力，可以对多重致病性大肠杆菌的侵袭提供更多的占位保护能力，重组菌株本身黏附能力的有效加强使其在与有害菌竞争肠道定植位点时处于优势地位，能有效保障动物体内肠道健康。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术以绿色荧光蛋白GFP作为报告基因，转化至不同肠毒素性大肠杆菌中，筛选出一株具有高转化效率的菌株作为改造、表达宿主。本专利技术提供了一种大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年9月18日，保藏编号为：CCTCCNO：M2019733，分类学命名Escherichiacoli。以及，所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311，其16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。以及，所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311菌株具有K99黏附素的应用。以及，所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311菌株制备成大肠杆菌与重组质粒pQE30-GFP相配合进行转化的应用。以及，所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311菌株作为宿主的应用。本专利技术提供的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311菌株具有高转化效率，是作为改造、表达的良好宿主。同时大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311菌株自身能表达K99黏附素，还能够大量表达外源质粒上的faeG基因，减少了基因重组所需的成本。本专利技术提供的菌株还能进一步重组为EscherichiacoliETECBE-311-faeG菌株，且该重组菌株具有保护肠道的作用。附图说明图1为ETECBE-311的革兰氏染色镜检图；图2为ETECBE-311的16SrRNA扩增电泳图；图3为ETECBE-311的肠毒素类型检测电泳图；图4为ETECBE-311的黏附素类型检测电泳图；图5为pQE30-GFP转化至各菌株荧光表达量对比图；图6为pQE30-GFP转化至不同菌株的日光平板图；图7为pQE30-GFP转化至不同菌株在蓝光激发下的荧光平板图；图8为双砷-四半胱氨酸系统特异性检测的荧光显微镜检测结果；图9为IPEC-J2细胞黏附实验的显微镜观察结果；图10为ETECBE-311-faeG在大鼠胃肠道中阻碍ETEC定植的作用探究的动物实验设计方案示意图。具体实施方式本专利技术提供如下技术方案：本专利技术从湖北省武汉市江夏区某养猪场腹泻仔猪粪便样品中分离、纯培养，经过革兰氏染色鉴定、16SrRNA扩增比对、肠毒素基因扩增后，得到多株肠毒性大肠杆菌；根据现有的大肠杆菌黏附蛋白基因序列设计引物，以多种肠毒素性大肠杆菌的DNA为模板，通过PCR扩增并确定不同菌株的黏附蛋白类型；以绿色荧光蛋白GFP作为报告基因，转化至不同肠毒素性大肠杆菌中，筛选出一株具有高转化效率的菌株(命名为EscherichiacoliETECBE-311)作为改造、表达宿主。一、细菌的分离纯化：用灭菌的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.2)将湖北省武汉市江夏区某养猪场腹泻仔猪粪粪便样品稀释100倍。将50μL稀释液加入含有普通营养琼脂培养基的培养皿中，并用“L”型一次性涂布棒涂匀。将接种后的培养皿置于37℃培养箱中培养12～16h。挑取可疑菌落在新培养基上进行划线接种。如此操作，分离和传代，革兰氏染色后，用光学显微镜观察分离细菌形态，判断细菌纯度。图1为ETECBE-311的革兰氏染色镜检图。其16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。16SrRNAPCR扩增与测序：按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取分离菌株的DNA，作为PCR扩增的模板。采用细菌的通用引物27F和1492R扩增分离菌株的16SrRNA，预计片段大小为1453bp。引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。反应体系(50μL)：2×HieffTMPCRMasterMix25μL、上下游引物各1μL、TemplateDNA1μL、Rnase-freeH2O22μL。PCR反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸44s，35个循环；72℃延伸10min；维持4℃。图2为ETECBE-311的16SrRNA扩增电泳图。二、肠毒素、黏附素基因检测：根据NCBI上已发表的序列信息，设计如表1菌株筛选鉴定所用引物表中所示的特异性引物，对分离得到的大肠杆菌进行肠毒素(LTa、LTb、ST1、ST2)和黏附素(K88、K99、987P、F41)基因检测，PCR反应体系及程序参照16SrRNA扩增步骤。图3为ETECBE-311的肠毒素类型检测电泳图，其中M：DL2000bpDNAMarker；泳道1：ST1；泳道2：ST1阳性对照；泳道3：ST2；泳道4：ST2阳性对照；泳道5：LTb；泳道6：LTb阳性对照；泳道7：LTa；泳道8：LTa阳性对照。图4为ETECBE-311的黏附素类型检测电泳图，M：DL2000bpDNAMarker；泳道1：BE-311菌毛类型检测；泳道2：标准菌株菌毛阳性对照。从图4中能看本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年9月18日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019733，分类学命名Escherichia coli。/n

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年9月18日，保藏编号为：CCTCCNO：M2019733，分类学命名Escherichiacoli。


2.根据权利要求1所述的大肠杆菌EscherichiacoliETECBE-311，其16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭小华，胡佳，张莉，卢霜，
申请(专利权)人：中南民族大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42