一种高产β-丙氨酸的基因工程菌及共培养制备D-泛酸制造技术

本发明专利技术涉及一种高产β‑丙氨酸的基因工程菌及共培养制备D‑泛酸及其构建方法，及其在共培养制备D‑泛酸中的应用。本发明专利技术通过利用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列替换基因组上panD、aspC，ppc基因的原有启动子以加强β‑丙氨酸的合成，并敲除基因pykA，pykF阻断PEP的消耗和改造大肠杆菌的葡萄糖摄取途径，加强非PTS转运系统而阻断PTS转运系统，积累合成的前体PEP；在此基础上引入异源的天冬氨酸脱羧酶基因panD,E.coli W3110的aspC以加强关键酶的酶活，增强β‑丙氨酸前体供给及转化，引入E.coli W3110的gdhA基因从而加强了辅酶NADP/DNAPH的循环再生，最终β‑丙氨酸的效价从0提高到2.48g/L。该菌株与之前的D‑泛酸生产菌株DPA21/pBCST3进行初步共培养体系的构建，进行了接种比例的优化，两个菌株接种比在1:1时，共培养菌株可以在同样的发酵培养基中生产3.08g/L的D‑泛酸。

【技术实现步骤摘要】
一种高产β-丙氨酸的基因工程菌及共培养制备D-泛酸(一)
本专利技术涉及一种高产β-丙氨酸的基因工程菌及共培养制备D-泛酸及其构建方法，及其在共培养制备D-泛酸中的应用。(二)
技术介绍
维生素B5，其性质偏酸并广泛存在于多种食物中，故又称为泛酸。泛酸存在两种构型——D型和L型，在生物体内只有D型具有生物活性。它是辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)合成的关键前体，CoA及ACP构成酰基转移酶的辅酶；但是它只能在植物及微生物体内合成，而动物需要依靠外界摄取，因此D-泛酸及其衍生物(D-泛酸钙和D-泛醇)在食品、医药、饲料、化妆品等领域有广泛的应用。由于其在酸、碱、光和热等条件下不稳定，所以在储存、运输、商品交易和使用时多采用更加稳定的形式——泛酸钙。1933年，D-泛酸首次由R.J.Williams等人从肝脏中提取出来，并在1940年通过化学方法成功合成得到。目前D-泛酸的生产方法主要有三种：化学法合成法、催化合成法和微生物发酵合成法。化学法需要得到β-丙氨酸和DL-泛解酸内酯两种关键中间体再用于D-泛酸的合成，其中β-丙氨酸主要通本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产β-丙氨酸的基因工程菌，按如下方法构建获得：/n(1)以基因工程菌E.coli CCTCC NO：M 2018914为出发菌株，将其基因组中的panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到工程菌E.coli W3110(DE3)，Trc-panD，记为ALA1；/n(2)将工程菌E.coli W3110(DE3)，Trc-panD基因组中的aspC基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC，记为ALA2；/n(3)将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC基因组中ppc基因的启动子替换为Tr...

【技术特征摘要】
1.一种高产β-丙氨酸的基因工程菌，按如下方法构建获得：
(1)以基因工程菌E.coliCCTCCNO：M2018914为出发菌株，将其基因组中的panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到工程菌E.coliW3110(DE3)，Trc-panD，记为ALA1；
(2)将工程菌E.coliW3110(DE3)，Trc-panD基因组中的aspC基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC，记为ALA2；
(3)将E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC基因组中ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc，记为ALA3；
(4)将E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc基因组中的pykA基因敲除，得到E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA，记为ALA4；
(5)将E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA基因组中的pykF基因敲除，得到E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF，记为ALA5；
(6)将E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF基因组中的ptsG基因敲除，得到E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG，记为ALA6；
(7)将E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG基因组中的glk基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG/Trc-glk，记为ALA7；
(8)以质粒pET28a为载体，连接来自CorynebacteriumglutamicumATCC13032的panD基因得到新的质粒pET28a-panD，记为pD；
(9)以步骤(8)构建好的质粒pD为载体，继续连接来自E.coliW3110的aspC基因得到新的质粒pET28a-panDaspC，记为pDC；
(10)以步骤(9)构建好的质粒pDC为载体，继续连接来自得E.coliW3110的gdhA基因得到新的质粒pET28a-panDaspCgdhA，记为pDCA；
(11)将步骤(10)构建好的质粒导入步骤(7)获得的菌株ALA7中，得到菌株ALA7/pDCA，即为所述高产β-丙氨酸的基因工程菌。


2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述Trc启动子序列如SEQIDNo.1所示，所述panD基因序列如SEQIDNo.2所示，所述aspC基因序列如SEQIDNo.3所示，所述gdhA基因序列如SEQIDNo.4所示。


3.构建权利要求1所述的基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)以基因工程菌E.coliCCTCCNO：M2018914为出发菌株，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将其基因组中的panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到工程菌E.coliW3110(DE3)，Trc-panD，记为ALA1；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，陈力，张博，李波，王培，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33