一种全细胞催化生产PAPS的方法技术

本发明专利技术公开了一种全细胞催化生产PAPS的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术在ATP硫酸化酶和APS激酶的基础上，引入辅酶PPA和PPK，实现了四种酶在微生物细胞内的同时合成。本发明专利技术将源于酿酒酵母的ATP硫化酶基因atps、源于产黄青霉菌的5’‑磷酸腺苷硫酸激酶基因apsk、源于大肠杆菌的无机焦磷酸水解酶酶基因ppa、源于谷氨酸棒状杆菌的多聚磷酸激酶基因ppk，通过不同的载体表达不同的基因，在微生物细胞内的同时合成，得到重组菌。所述重组菌以ATP二钠盐为底物，利用重组菌进行全细胞催化生产PAPS，并通过优化催化条件，催化反应15h后转化率达到96.12％；在反应过程中优化补料条件，催化16h后转化率可达97.8％。

【技术实现步骤摘要】
一种全细胞催化生产PAPS的方法
本专利技术涉及一种全细胞催化生产PAPS的方法，属于生物工程

技术介绍
3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)是GAG硫酸转移酶催化肝素、硫酸软骨素等合成过程中直接的硫酸基供体。PAPS的生产方法包括发酵法和生物催化法。发酵法以细胞自身代谢途径为基础，通过引入外源基因实现从ATP到PAPS的合成。然而，在正常条件下，细胞内的ATP浓度较低，且其中绝大部分的ATP用于细胞自身的能量代谢，导致最终产量极低。而且发酵过程会产生不同种类的副产物，不利于后期产品的分离纯化。目前，研究人员一般采用体外酶法制备PAPS。体外酶法催化制备PAPS主要包括两种方法：酰基磺酸转移酶催化3,5-二磷酸腺苷(PAP)合成PAPS、ATP硫酸化酶和APS激酶催化ATP制备PAPS。然而，3,5-二磷酸腺苷价格昂贵，酰基磺酸转移酶催化合成PAPS仅在实验室进行小规模试验，不适合工业化生产。ATP硫酸化酶和APS激酶催化存在酶纯化过程复杂，产物抑制等问题，导致PAPS规模化生产受限。目前商品化试剂PAPS采用酶法合成，价格非常昂贵(20559.40元/25mg，纯度仅60％)，远高于硫酸软骨素和肝素。因此，而还缺乏高效、简便、价格低廉的制备PAPS的方法。
技术实现思路
目前制备PAPS的方法还是局限于利用纯化后的酶进行转化，过程复杂、转化成本高，不利于PAPS的工业化制备。为实现PAPS的高效合成，本专利技术在ATP硫酸化酶和APS激酶的基础上，引入辅酶PPA和PPK，实现了四种酶在微生物细胞内的同时合成。这不仅消除了反应副产物抑制，而且提高了底物利用效率。其次，通过提高细胞膜的通透性，实现全细胞转化生产PAPS。这种生产方式，对设备要求低，只需一步反应，简便快捷，效率高。转化的过程中不用额外添加其他化学物质或者生物辅因子，降低了成本，减轻了对环境的污染。反应具有高选择性，产品纯度高，方便后期的分离与纯化，有利于大规模的工业化生产。本专利技术提供了一种重组菌，所述重组菌将腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶(ATPS)、5’-磷酸腺苷硫酸激酶(APSK)、无机焦磷酸水解酶(PPA)、多聚磷酸激酶(PPK)同时在宿主菌中表达。在一种实施方式中，所述腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶来源于酿酒酵母；所述5’-磷酸腺苷硫酸激酶来源于产黄青霉菌；所述无机焦磷酸水解酶来源于大肠杆菌；所述多聚磷酸激酶来源于谷氨酸棒状杆菌。在一种实施方式中，所述腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述5’-磷酸腺苷硫酸激酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述无机焦磷酸水解酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述多聚磷酸激酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在一种实施方式中，以大肠杆菌为宿主。在一种实施方式中，利用pETDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pRSFDuet-1载体表达PPA和PPK在一种实施方式中，利用pCDFDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pETDuet-1载体表达PPA和PPK。在一种实施方式中，利用pRSFDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pACYCDuet-1载体表达PPA和PPK。在一种实施方式中，pACYCDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pETDuet-1载体表达PPA和PPK。在一种实施方式中，利用pCDFDuet-1载体表达ATPS和APSK、利用pRSFDuet-1载体表达PPA和PPK。在一种实施方式中，利用pETDuet-1载体表达ATPS和APSK，利用pACYCDuet-1载体表达PPA和PPK。本专利技术提供了一种生产3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸的方法，以ATP为底物，利用所述重组菌全细胞转化生产3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸。在一种实施方式中，底物ATP优选为ATP二钠盐。在一种实施方式中，将重组菌培养至OD600为0.6-0.8，利用IPTG诱导10-15h后，收集菌体，在利用曲拉通对菌体处理20-40min。在一种实施方式中，将曲拉通处理过后的菌体加入转化体系中，使其在转化体系中的浓度为15-30g/L。在一种实施方式中，转化体系中底物浓度为40-80mM，或初始底物浓度为10-20mM。在一种实施方式中，当底物浓度为10-20mM时，在反应过程中需进行补料50-60mM。在一种实施方式中，底物浓度为10mM时，在反应第1～3h，每1h一次性补料浓度为10mM，后每2～3h一次性补料浓度为10mM，反应共消耗底物70mM。在一种实施方式中，转化温度为30-45℃。在一种实施方式中，转化体系中还含有10-20mM(NaPO3)6，100-150mMLiCl，50-100mMMgSO4。在一种实施方式中，转化体系初始pH为7.5。在一种实施方式中，反应时间为13-16h。本专利技术还提供了所述重组菌，或所述方法在制备3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸中的应用。有益效果：本专利技术引入催化模块和辅酶模块，实现了四种酶在大肠杆菌中的同时表达，并且以此重组菌株实现了全细胞转化ATP生产PAPS。利用重组菌进行全细胞催化生产PAPS，并通过优化催化条件，催化反应15h后转化率达到96.12％；在反应过程中优化补料条件，催化16h后转化率可达97.8％。与现有的技术相比，本专利技术产量高，且采用的方法反应条件温和，过程简单，便于后期的提取分离，适合工业化生产。附图说明图1为全细胞催化合成PAPS的合成路径示意图；图2为12种重组菌株转化生产PAPS结果；图3为菌体量对转化效率响图；图4为底物浓度对转化效率响图；图5为转化温度对转化效率响图；图6为补料转化生产PAPS图。具体实施方式种子培养基(g/L)：蛋白胨10g，酵母粉3g，NaCl10g，蒸馏水定容。发酵培养基：葡萄糖4g/L，胰蛋白胨24g/L，酵母膏12g/L，磷酸二氢钾2.3g/L，磷酸氢二钾16.4g/L。实施例1：密码子优化与载体的构建本专利技术所用的ATP硫化酶atps来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的、5’-磷酸腺苷硫酸激酶apsk源于产黄青霉菌(PenicilliumChrysogenum)的、无机焦磷酸水解酶酶ppa源于大肠杆菌(Escherichiacoli)、多聚磷酸激酶基因ppk源于谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，分别进行密码子优化和人工合成，序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示。构建催化模块表达载体：将atps和apsk的编码基因，分别连接至载体pACYCDuet-1、pETDuet-1、pRSFDuet-1、pCDFDuet-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组菌，其特征在于，将腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶、5’-磷酸腺苷硫酸激酶、无机焦磷酸水解酶、多聚磷酸激酶同时在大肠杆菌中表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组菌，其特征在于，将腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶、5’-磷酸腺苷硫酸激酶、无机焦磷酸水解酶、多聚磷酸激酶同时在大肠杆菌中表达。


2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶来源于酿酒酵母；所述5′-磷酸腺苷硫酸激酶来源于产黄青霉菌；所述无机焦磷酸水解酶来源于大肠杆菌；所述多聚磷酸激酶来源于谷氨酸棒状杆菌。


3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述腺嘌呤核苷三磷酸硫化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述5’-磷酸腺苷硫酸激酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述无机焦磷酸水解酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述多聚磷酸激酶的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。


5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，将腺嘌呤核苷三磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，刘开放，梁光杰，高聪，刘佳，陈修来，宋伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32