一种重组需钠弧菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种重组需钠弧菌及其应用。本发明专利技术提供一种重组需钠弧菌，所述重组需钠弧菌表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶，且所述重组需钠弧菌与野生型需钠弧菌相比，具有降低的转录调控因子的表达和/或酶活性，所述转录调控因子为arcA和/或glpR。本发明专利技术通过改造需钠弧菌，使其能够高效利用甘油发酵生产1,3‑丙二醇，1,3‑丙二醇的产量高，副产物少，提取分离过程简单；而且，使用需钠弧菌解决了传统1,3‑丙二醇生产菌株潜在的生物安全性问题以及菌株对粗甘油中盐的耐受性较低的问题，具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种重组需钠弧菌及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组需钠弧菌及其应用。
技术介绍
1,3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，其最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二甲酸聚合生成聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT与PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PBT(聚对苯二甲酸丁二醇酯)相比具有更优良的性能，例如：更好的耐污染性、韧性和回弹性以及抗紫外性能等，此外，还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点。因此PTT被认为是PET的升级产品，具有广阔的市场前景。目前，1,3-丙二醇的生产方法主要是利用微生物转化甘油或者葡萄糖进行生产。近年来，由于生物柴油产业的快速发展，作为生物柴油副产物的甘油的价格急剧下降，使得利用粗甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法具有重要的工业应用价值。目前利用甘油生产1,3-丙二醇主要是利用一些天然的微生物如克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)、丁酸梭状芽胞杆菌(Clostridiumbutyricum)及弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)等在厌氧或者微氧的条件下进行。目前甘油法生产1,3-丙二醇工艺路线的主要缺点是：(1)常用的1,3-丙二醇生产菌株如克雷伯氏肺炎杆菌等为条件致病菌，其生产过程中生物安全性需要严格控制；(2)大量副产物如乙酸、乳酸，丁二酸，2,3-丁二醇的合成，使得整个后提取过程变得十分复杂；(3)粗甘油中含有高浓度的NaCl，会抑制菌体的生产性能，从而降低利用粗甘油生产1,3-丙二醇的产量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组需钠弧菌，该菌株能够利用甘油高效生产1,3-丙二醇。本专利技术的另一目的是提供该重组需钠弧菌的应用以及制备1,3-丙二醇的方法。为实现上述目的，本专利技术开发能够以甘油(尤其是粗甘油)为底物，具有较高1,3-丙二醇产量和较低副产物的重组微生物。在众多的微生物中，本专利技术选择需钠弧菌(Vibrionatriegens)作为出发菌株构建能够产生1,3-丙二醇的重组需钠弧菌，需钠弧菌是目前已知的生长最快的微生物，且能耐受高浓度盐，但是其本身并不能合成1,3-丙二醇。本专利技术首先将1,3-丙二醇合成模块导入需钠弧菌中，但发现仅导入合成模块的重组菌的1,3-丙二醇产量很低，在进一步对菌株进行代谢工程改进的过程中，本专利技术创造性地发现了能够有效促进1,3-丙二醇积累的改造靶点，并通过多个改造靶点的组合和适配性优化，显著提高了需钠弧菌利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的性能。具体地，本专利技术提供以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种重组需钠弧菌，该重组需钠弧菌表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶，且与野生型需钠弧菌相比，该需钠弧菌具有降低的转录调控因子的表达和/或酶活性，所述转录调控因子为arcA和/或glpR。本专利技术发现，单独降低需钠弧菌的转录调控因子arcA、glpR的表达量或活性，均能够显著促进需钠弧菌合成1,3-丙二醇，而且，将两者组合改造，同时降低转录调控因子arcA和glpR的表达量或活性，促进需钠弧菌合成1,3-丙二醇的效果更优。以上所述的转录调控因子arcA的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示，转录调控因子glpR的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。因此，具体地，本专利技术提供以下任一种重组需钠弧菌：(1)该重组需钠弧菌表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶，且与野生型需钠弧菌相比，该需钠弧菌具有降低的转录调控因子arcA的表达和/或酶活性；(2)该重组需钠弧菌表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶，且与野生型需钠弧菌相比，该需钠弧菌具有降低的转录调控因子glpR的表达和/或酶活性；(3)该重组需钠弧菌表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶，且与野生型需钠弧菌相比，该需钠弧菌具有降低的转录调控因子arcA和glpR的表达和/或酶活性。为配合arcA、glpR的靶点改造，本专利技术进一步对1,3-丙二醇合成模块(PDO)的酶的选择进行了优化。具体地，所述甘油脱水酶和所述甘油脱水酶激活因子来源于克雷伯氏肺炎杆菌。所述醇脱氢酶来源于大肠杆菌。优选地，所述甘油脱水酶DhaBCE的氨基酸序列如SEQIDNO.1-3所示，所述甘油脱水酶激活因子OrfXY的氨基酸序列如SEQIDNO.4-5所示，所述醇脱氢酶YqhD的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。以上所述的甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的表达可通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：(1)导入携带甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因的表达质粒；(2)在基因组上整合一个或多个拷贝的甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因。对于导入携带上述酶的编码基因的质粒的方式，这些编码基因可存在于同一质粒上，或者分别存在于不同的质粒上。对于表达质粒，本专利技术没有特别的限制，只要能够在需钠弧菌中克隆、进行基因表达的质粒均可使用。对于质粒的拷贝数，本专利技术没有特别的限制，可为高拷贝质粒、中拷贝质粒或低拷贝质粒。优选采用拷贝数为5～100的质粒，例如：pXMJ19、pTrc99a等。作为本专利技术的优选方案，将甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因置于一个质粒上进行表达，质粒的拷贝数为20～50。具体地，将甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因置于pTrc99a上，从距离pTrc99a多克隆位点区启动子由近至远的方向，依次为甘油脱水酶编码基因、甘油脱水酶激活因子编码基因和醇脱氢酶编码基因。对于在基因组上整合上述酶的编码基因的方式，整合编码基因的拷贝数至少为1个，对于整合拷贝数的具体数量，本专利技术没有特别的限制，优选的整合拷贝数为1～10个。本专利技术所述的表达和/或酶活性的降低可通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：(1)对所述转录因子的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得转录因子失活、表达量或活性降低；(2)将所述转录因子的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件。上述重组需钠弧菌能够利用甘油发酵生产1,3-丙二醇，具有较高的产量，但是，由于携带表达质粒，在发酵时需要添加抗生素维持质粒的稳定性。本专利技术进一步提供了一种重组需钠弧菌，该菌株在发酵时不需要添加抗生素维持质粒的稳定性。本专利技术对有利于维持表达质粒稳定性的改造靶点进行了大量筛选，最终发现将甘油-3-磷酸脱氢酶失活并将其在质粒在表达质粒上表达，能够显著提高该表达质粒的稳定性，使得在不添加抗生素进行发酵的情况下，该质粒也能够在发酵过程中稳定存在。基于此，以上所述的重组需钠弧菌的基因组甘油-3-磷酸脱氢酶编码基因被失活，且携带含有甘油-3-磷酸脱氢酶编码基因的表达质粒。优选地，所述表达质粒上还含有甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因。以上所述的甘油-3-磷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组需钠弧菌，其特征在于，所述重组需钠弧菌表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶，且所述重组需钠弧菌与野生型需钠弧菌相比，具有降低的转录调控因子的表达和/或酶活性，所述转录调控因子为arcA和/或glpR。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组需钠弧菌，其特征在于，所述重组需钠弧菌表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶，且所述重组需钠弧菌与野生型需钠弧菌相比，具有降低的转录调控因子的表达和/或酶活性，所述转录调控因子为arcA和/或glpR。


2.根据权利要求1所述的重组需钠弧菌，其特征在于，所述甘油脱水酶和所述甘油脱水酶激活因子来源于克雷伯氏肺炎杆菌，和/或，所述醇脱氢酶来源于大肠杆菌；
优选地，所述甘油脱水酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1-3所示，所述甘油脱水酶激活因子的氨基酸序列如SEQIDNO.4-5所示，所述醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。


3.根据权利要求1或2所述的重组需钠弧菌，其特征在于，所述甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的表达通过导入携带甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因的表达质粒和/或在基因组上整合一个或多个拷贝的所述编码基因实现。


4.根据权利要求1或2所述的重组需钠弧菌，其特征在于，所述表达和/或酶活性的降低通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：
(1)对所述转录因子的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得所述转录因子失活、表达量或活性降低；
(2)将所述转录因子的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈振，张冶，刘德华，
申请(专利权)人：清华大学，广东清大智兴生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11