一株变形假单胞菌znuA基因稳定沉默菌株及应用制造技术

本发明专利技术通过基因沉默技术构建了一株变形假单胞菌

【技术实现步骤摘要】
一株变形假单胞菌znuA基因稳定沉默菌株及应用
本专利技术属于微生物
，更具体涉及一株具有研究变形假单胞菌致病机理价值的菌株。
技术介绍
变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)是大黄鱼、斜带石斑鱼等海水养殖鱼类“内脏白点病”的病原菌，每年造成的直接经济损失超亿元。Zn(II)是细菌不可缺少的物质，存在于许多参与核酸代谢过程的蛋白质和酶中，以及一些核糖体蛋白中。在缺乏锌的情况下，ZnuABC和ZupT是许多细菌最保守的锌转运系统，ZnuABC失活会降低细菌的毒力和定植能力。ZnuABC转运体由ZnuA、ZnuB和ZnuC组成。ZnuA是一种可溶的周质成分，它捕获Zn(II)并将其传递给膜渗透酶(ZnuB)，而ZnuC提供离子通过内膜运输所需的能量。研究发现，ZnuA在Zn(II)摄取中起关键作用，znuA基因失活将导致细菌毒性的降低，ZnuB不能弥补ZnuA缺失的不足。已有研究表明，敲除胸膜肺炎放线菌znuA基因不仅能降低细菌的毒力，还能有效保护宿主免受同源或异源细菌的攻击。迄今为止，还没有关于变形假单胞菌znuA基因对宿主影响的报道。因此,探明变形假单胞菌znuA基因在病原-宿主互作中的功能能够揭示其对变形假单胞菌致病性的意义。本专利技术通过基因沉默技术构建了一株变形假单胞菌znuA基因稳定高效沉默菌株，然后通过人工感染实验确定znuA基因稳定高效沉默菌株对斜带石斑鱼的致病性，并利用dualRNA-seq技术对野生菌株和znuA基因稳定沉默高效菌株感染后的斜带石斑鱼脾脏的转录组数据进行分析，同时对宿主和病原菌的转录组数据进行研究，从转录组层面探讨znuA基因在变形假单胞菌与斜带石斑鱼互作中的功能，进而揭示了znuA基因对变形假单胞菌毒力的影响。本专利技术所构建的变形假单胞菌znuA基因稳定高效沉默菌株对斜带石斑鱼的致病力极显著下降，而且能够引起感染脾脏中变形假单胞菌和斜带石斑鱼转录组数据发生显著变化，因此该菌株可用于研究变形假单胞菌的致病机理，特别是从病原-宿主互作研究变形假单胞菌的致病机理有着独特的优势。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一株变形假单胞菌znuA基因稳定高效沉默菌株，揭示znuA基因在转录组层面对变形假单胞菌毒力的影响，明确了该菌株的应用范围；为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：一株变形假单胞菌znuA基因稳定高效沉默菌株，所述菌株命名为PseudomonasplecoglossicidaznuA-RNAi，该菌株已于2019年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2019693，中国典型培养物保藏中心地址为中国武汉，武汉大学。本专利技术提供的这株变形假单胞菌znuA基因稳定高效沉默菌株的构建技术路线及其功能，步骤一：通过比较转录组学分析，筛选得到感染过程中脾脏内表达量提高的znuA基因；步骤二：合成shRNA引物，退火后连入pCM130/tac载体，通过电转技术导入变形假单胞菌感受态细胞，构建变形假单胞菌znuA基因稳定高效沉默菌株；利用qRT-PCR技术验证各菌株的沉默效果；步骤三：用相同剂量的变形假单胞菌野生株和znuA基因稳定高效沉默株分别感染斜带石斑鱼，明确znuA基因对变形假单胞菌毒力的影响。步骤四：利用dualRNA-seq技术对znuA基因稳定高效沉默株和野生株变形假单胞菌感染后的斜带石斑鱼的脾脏进行转录组测序，比较分析znuA基因的沉默对变形假单胞菌和斜带石斑鱼基因表达的影响。通过基因测序和比对，本专利技术提供的菌株为一株变形假单胞菌znuA基因稳定高效沉默菌株，揭示了znuA基因对变形假单胞菌毒力的影响以及在病原-宿主互作中的功能。znuA基因的基因序列（SEQIDNO.1）为：ATGTTCCGTTCCGCCCTCGCCCTGCTGCTGGCCTGCGCCTTCCCCGTGCTGGCCCTGGCCGATACCGGCAAACCCCTGCGCATCGGTATCACCCTGCACCCTTACTACAGCTACGTGAGCAACATCGTCGGCGACAAGGCCGAAGTGGTACCGCTGATCCCGGCGGGCTTCAACCCGCACGCCTACGAGCCACGGGCCGAGGACATCAAGCGCATCGGCACCCTGGACGTGGTGGTGCTCAACGGCGTCGGCCATGACGACTTCGCCGACCGCATGATCGCCGCCAGCGAAAAGCCCGACATCAAGACCATCGAGGCCAACCAGAACGTGCCACTGCTGGCGGCCACCGGCATCGCCGCCCGCGGCGCCGGCAAGGTGGTCAACCCGCACACCTTCCTGTCGATCAGCACCACCATCGCCCAGGTCAACAACATCGCCCGCGAACTGGGCAAGCTCGACCCGGACAACGCCAAGTTCTACACGCAGAACGCCCGGGCCTATGCCAAGCGCCTGCGCGCCCTGCGCGCCGAGGCCCTGGCCAAGGTCAGCGAAGCACCCGATGCCACCTTCCGCGTGGCCACCATCCACGCCGCCTACGACTACCTGGTGCGCGACTTCGGCCTGGAAGTGACCGCGGTGGTCGAGCCGGCCCACGGTATCGAGCCGAGCCCGGCACAACTGAAGAAGACCATCGACCAGCTCAAGGCGCTGGACGTCAAGGTGATCTTCTCGGAGATGGATTTCCCCTCGGCCTATGTCGAGACCATCCAGCGCGAATCCGGCGTACGCCTGTACCCGCTGACGCACATTTCCTATGGCGAATACACCCAGGACAAGTACGAAGTGGAGATGAAGCGCAACCTCGACACCGTGGTCCGCGCCATCCAGGAGAACCGCGCATGA。本专利技术的优点在于：变形假单胞菌znuA基因稳定高效沉默菌株感染的斜带石斑鱼的死亡率为0，而变形假单胞菌野生株感染后斜带石斑鱼的死亡率为100%，说明znuA基因是变形假单胞菌重要的毒力基因。DualRNA-seq分析结果表明，znuA基因的稳定沉默不仅能够显著影响变形假单胞菌的转录组表达，而且也能显著影响斜带石斑鱼的转录组表达，这说明变形假单胞菌znuA基因稳定高效沉默菌株可用于研究病原-宿主互作以及变形假单胞菌的致病机理。附图说明图1：变形假单胞菌znuA-RNAi菌株的构建及生长曲线。(A)：5个突变株znuA基因的表达水平。(B)：野生型菌株与znuA稳定高效沉默菌株的生长曲线。***p<0.001。图2：变形假单胞菌对斜带石斑鱼的感染。(A)：不同菌株感染的斜带石斑鱼动态存活率。(B)：不同菌株感染的斜带石斑鱼的脾症状。(C)：znuA基因在野生型菌株和znuA稳定高效沉默菌株中的表达水平。(D)：znuA稳定高效沉默菌株与野生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株变形假单胞菌

【技术特征摘要】
1.一株变形假单胞菌znuA基因稳定高效沉默菌株，其特征在于，所述菌株命名为PseudomonasplecoglossicidaznuA-RNAi，该菌株已于2019年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2019693。


2.一种如权利要求1所菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）通过比较转录组学分析，筛选得到感染过程中脾脏内表达量显著提高的znuA基因；
（2）针对...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵玲敏，王路英，鄢庆枇，何乐，黄力行，覃映雪，徐晓津，马英，郑江，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35