新型双特异性激动性4-1BB抗原结合分子制造技术

本发明专利技术提供了一种新型双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型双特异性激动性4-1BB抗原结合分子


[0001]本专利技术涉及一种新型双特异性抗原结合分子，其包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成，其中Fab片段(a)和(b)彼此融合。本专利技术进一步涉及生产这些分子的方法和使用它们的方法。

技术介绍

[0002]4-1BB(CD137)是TNF受体超家族的成员之一，其最初被鉴定为通过T细胞活化诱导表达的分子(Kwon Y.H.和Weissman S.M.(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1963-1967)。后续研究证明了4-1BB在T淋巴细胞和B淋巴细胞(Snell L.M.等人(2011)Immunol.修订版，244，197-217；或Zhang X.等人(2010)，J.Immunol.184，787-795)、NK细胞(Lin W.等人(2008)，Blood 112，699-707)、NKT细胞(Kim D.H.等人(2008)，J.Immunol.180，2062-2068)、单核细胞(Kienzle G.和von Kempis J.(2000)，Int.Immunol.12，73-82；或Schwarz H.等人(1995)，Blood 85，1043-1052)、中性粒细胞(Heinisch I.V.等人(2000)，Eur.J.Immunol.30，3441-3446)、肥大细胞(Nishimoto H.等人(2005)，Blood 106，4241-4248)和树突细胞以及非造血来源的细胞诸如内皮细胞和平滑肌细胞(Broll K.等人(2001)，Am.J.Clin.Pathol.115，543-549；或Olofsson P.S.等人(2008)，Circulation 117，1292-1301)中的表达。4-1BB在不同细胞类型中的表达大多数是可诱导的，并且受各种刺激信号诸如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发以及通过共刺激分子或促炎细胞因子的受体诱导的信号传导的驱动(Diehl L.等人(2002)，J.Immunol.168，3755-3762；von Kempis J.等人(1997)，Osteoarthritis Cartilage 5，394-406；Zhang X.等人(2010)，J.Immunol.184，787-795)。
[0003]已知CD137信号传导刺激NK细胞的IFNγ分泌和增殖(Buechele C.等人(2012),Eur.J.Immunol.42，737-748；Lin W.等人(2008)，Blood 112，699-707；Melero I.等人(1998)，Cell Immunol.190，167-172)，并且促进DC活化(其表现为存活率增加以及分泌细胞因子和上调共刺激分子的能力的提高)(Choi B.K.等人(2009),J.Immunol.182，4107-4115；Futagawa T.等人(2002)，Int.Immunol.14，275-286；Wilcox R.A.等人(2002)，J.Immunol.168，4262-4267)。但是，CD137最大的特征在于作为一种共刺激分子，其调节T细胞的CD4
+
和CD8
+
亚群中TCR诱导的活化。与TCR触发相结合，激动性4-1BB特异性抗体增强T细胞增殖、刺激淋巴因子分泌并且降低T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(Snell L.M.等人(2011)Immunol.修订版，244，197-217)。与4-1BB抗体在体外对T细胞的这些共刺激作用一致，在许多实验性肿瘤模型中，将它们施用于荷瘤小鼠产生有效的抗肿瘤作用(Melero I.等人.(1997)，Nat.Med.3，682-685；Narazaki H.等人(2010)，Blood 115，1941-1948)。体内耗竭实验表明，CD8
+ T细胞在4-1BB特异性抗体的抗肿瘤作用中发挥至关重要的作用。但是，根据肿瘤模型或包括抗4-1BB在内的联合疗法不同，已经报道了其他类型的
细胞诸如DC、NK细胞或CD4
+ T细胞的贡献(Murillo O.等人(2009)，Eur.J.Immunol.39，2424-2436；Stagg J.等人(2011)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108，7142-7147)。
[0004]看来4-1BB激动性抗体在体内的免疫调节特性要求抗体分子上存在野生型Fc部分，由此暗示Fc受体结合是此类试剂的药理活性所需的重要事件，其已被描述为对TNFR超家族的其他细胞凋亡诱导或免疫调节成员具有特异性的激动性抗体(Li F.和Ravetch J.V.(2011)，Science 333，1030-1034；Teng M.W.等人(2009)，J.Immunol.183，1911-1920)。但是，全身施用具有功能活性Fc结构域的4-1BB特异性激动性抗体还在小鼠体内不存在功能性Fc受体的情况下诱导CD8
+ T细胞扩增，其与肝毒性减弱或明显改善相关联(Dubrot J.等人(2010)，Cancer Immunol.Immunother.59，1223-1233)。
[0005]Urelumab(BMS-666513，克隆10C7)是一种完整的人激动性非配体阻断单克隆IgG4抗体，其与4-1BB细胞外结构域结合。在美国专利号7,288,638中，将其公开为20H4.9-IgG4。在人体临床试验(ClinicalTrials.gov，NCT00309023和NCT00612664)中，每三周给予一次Urelumab治疗并且持续12周，可诱导黑素瘤、卵巢癌或肾细胞癌患者的疾病稳定。但是，由于发生抗体引起的4级肝炎所导致的两例肝毒性相关的死亡，因此这些试验终止(Simeone E.和Ascierto P.A.(2012)，J.Immunotoxicology 9，241-247)。随后对临床安全性数据进行的详细分析表明，重度转氨酶升高的发生主要是由给定的Urelumab剂量引起。还观察到2+级中性粒细胞减少、白细胞减少和血小板减少症。随后对临床安全性数据进行的详细分析表明，重度转氨酶升高的发生主要是由给定的Urelumab剂量引起。2012年，Urelumab再次进入临床开发阶段，但条件是采用<1mg/kg的剂量并且每三周给药一次。目前的推荐剂量为每三周给予0.1mg/kg(N.Segal等人(2016)，Results From an Integrated Safety Analysis of Urelumab,an Agonist Anti-CD137 Monoclonal Antibody，Clin.Cancer Res.，在线发表于2016年12月1日)。考虑到剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种双特异性抗原结合分子，包含：(a)第一Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；(b)第二Fab片段，其能够特异性结合到靶细胞抗原；(c)第三Fab片段，其能够特异性结合到4-1BB；以及(d)Fc结构域，其由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成；其中所述第二Fab片段(b)在所述Fab重链的C末端融合至所述第一Fab片段(a)的Fab重链的N末端，其继而在其C末端融合至所述第一Fc结构域亚基的所述N末端，并且所述第三Fab片段(c)在所述Fab重链的所述C末端融合至所述第二Fc结构域亚基的所述N末端，并且其中在所述能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段中，(i)可变结构域VL和VH彼此替换，或(ii)恒定结构域CL和CH1彼此替换。2.根据权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子提供与4-1BB的二价结合和与所述靶细胞抗原的单价结合。3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中所述由能够稳定结合的第一亚基和第二亚基组成的Fc结构域为IgG Fc结构域，具体地为IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中根据突起进入孔方法，所述Fc结构域的所述第一亚基包含突起并且所述Fc结构域的所述第二亚基包含孔。5.根据权利要求1至4中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代降低所述抗原结合分子与Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能，具体地为氨基酸突变L234A、L235A和P329G(根据Kabat EU索引编号)。6.根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(V
H
4-1BB)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
4-1BB)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。7.根据权利要求1至6中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段各自包含：重链可变区(V
H
4-1BB)，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
4-1BB)，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。8.根据权利要求1至7中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中在所述能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段的所述恒定结构域CL中，124位的氨基酸被赖氨酸(K)取代(根据Kabat EU索引编号)并且123位的氨基酸被精氨酸(R)或赖氨酸(K)取代(根据Kabat EU索引编号)，并且其中在所述能够特异性结合到4-1BB的第一Fab片段和第三Fab片段的所述恒定结构域CH1中，147位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)并且213位的氨基酸被谷氨酸(E)取代(根据Kabat EU索引编号)。9.根据权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第二Fab片段
能够特异性结合到选自由以下项组成的组中的靶细胞抗原：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD33和PD-L1。10.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到靶细胞抗原的第二Fab片段为能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段。11.根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：(a)重链可变区(V
H
FAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
FAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；或者(b)重链可变区(V
H
FAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
FAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。12.根据权利要求1至11中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：(a)重链可变区(V
H
FAP)，其包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
FAP)，其包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者(b)重链可变区(V
H
FAP)，其包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
FAP)，其包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。13.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段为能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段。14.根据权利要求1至9或权利要求13中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到癌胚抗原(CEA)的Fab片段包含：(a)重链可变区(V
H
CEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
CEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列；或者(b)重链可变区(V
H
CEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
CEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:38的
氨基酸序列；或者(c)重链可变区(V
H
CEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
CEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列；或者(d)重链可变区(V
H
CEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
CEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列；或者(e)重链可变区(V
H
CEA)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
CEA)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列，(...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：豪夫迈，
类型：发明
国别省市：