抗PD-L1纳米抗体制造技术

本发明专利技术提供了一类特异性抗PD-L1以及阻断PD-L1/PD-1相互作用的纳米抗体，基于所述纳米抗体制备的人源化抗体以及融合蛋白，以及它们的应用。的应用。

【技术实现步骤摘要】
抗PD-L1纳米抗体


[0001]本专利技术涉及生物领域，特别是涉及抗人PD-L1的纳米抗体及其应用。

技术介绍

[0002]程序性死亡因子1配体1(programmed death 1 ligand 1，PD-L1)最初是作为B7蛋白家族中的成员(称为B7-H1)克隆(Dong等人，1999NatureMed 5:1365)。PD-L1属于I型跨膜蛋白，共290个氨基酸，包含1个IgV样区、1个IgC样区、1个跨膜疏水区和1个由30个氨基酸组成的胞内区。PD-L1广泛表达在多种免疫细胞、上皮细胞和肿瘤细胞表面。PD-L1结合至编程性死亡-1(Programmed Death-1；PD-1)受体及活化负调节信号传导途径，从而抑制T细胞激活或诱导T细胞凋亡，使免疫反应受到抑制(Freeman等人，2000J Exp Med 192:1027)。肿瘤发展过程中，癌细胞会通过上调PD-L1表达，诱导T细胞的凋亡，避免免疫系统对其的清除，从而导致疾病的进展。近年来，利用靶向PD-1/PD-L1蛋白的单克隆抗体药物，通过阻断PD-1/PD-L1的结合，进而促进体内T细胞的活化和增殖，达到杀伤肿瘤细胞的目的，已在多种肿瘤，如黑色素瘤、淋巴癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌等治疗应用，取得显著的疗效。因此，PD1/PD-L1通路已成为抗肿瘤药物研究的重要靶点。目前，抑制PD1/PD-L1通路的抗体药物，已经在临床上获得巨大成功，其中，百时美施贵宝的Nivolumab，默沙东的MK-3475和罗氏的MPDL3280A先后上市。针对PD1/PD-L1通路的抗体药物，将成为肿瘤治疗市场中的最具潜力的领域。
[0003]单克隆抗体在癌症的检测及生物靶向治疗方面成功的应用，引起了肿瘤治疗的变革。然而，传统的单克隆抗体(约150kD)分子质量过大，难穿透组织，造成肿瘤区域的有效浓度较低，治疗效果不充分；传统的抗体具有很高的免疫原性，而改造的抗体很难达到原来的亲和力。此外，完全人源化的传统抗体开发周期长，生产成本高，稳定性不够等诸多因素限制其在临床中的应用及普及。随后出现的纳米抗体有来源于成年骆驼体内重链抗体的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力。纳米抗体和常规抗体相比具有许多独特的性质：1)纳米抗体编码的序列与人VH家族3和4同源性高，使得它免疫原性弱；2)纳米抗体分子量小，仅15kDa左右，结构简单，很容易在微生物中大量表达，易于纯化。纳米抗体的独特性质和低成本使其应用范围大为拓展，显示出其在疾病的治疗和诊断中具有的价值。但是，现有技术中，本领域技术人员在筛选纳米抗体中尚存在困难、不易于获得高亲和力、高特异性且具有产业化前景的纳米抗体，仅以三个互补决定区(CDR)发挥结合抗原作用的抗体的筛选要远远难于以6个CDR区来发挥结合抗原作用的抗体，这也使得目前真正商品化或临床前在研的主流抗体仍然是分子量较大的单克隆抗体。不仅如此，目前本领域所获得的纳米抗体在应用上也存在诸多问题，比如因为其特殊结构导致的免疫原性(ADA)问题。TAS266是一个anti-DR5受体纳米抗体，在Ⅰ期临床研究中就因为存在严重的肝毒性而中止了开发。进一步研究发现其肝脏毒性与受试者体内存在的ADA密切相关(Papadopoulos,K.P.,Isaacs,R.,Bilic,S.et al.Cancer Chemother Pharmacol(2015)75:887.)。在另一个anti-TNFR1的VHH抗体(GSK1995057)Ⅰ期临床试验中，也因为受试者体
内存在ADA导致细胞因子风暴而中止了临床研究(Journal of Clinical Immunology,2013,Volume 33,Number 7,Page 1192M.C.Holland,J.U.Wurthner,P.J.Morley)。单重链抗体(VHH)，为了实现在没有轻链的条件下保持高亲和力和稳定性，其框架区和CDR跟常规人源抗体有一定差异。特别是CDR3的结构往往差异更大。很多时候，筛选获得的高亲和力VHH的CDR3区的氨基酸组成和长度与人源抗体序列有着较大的差异(Nature(1993)363:446-8；Protein Eng(1994)7:1129-35.；Mol Immunol(1997)34:1121-31)。比如，高亲和力VHH的CDR3区往往长度更长，还经常存在Cys，甚至会形成二硫键(Protein Engineering,Design&Selection，24(9)：727tein，2011)。WO2017/020801A1中的SEQ ID NO:28的PDL1-56序列中CDR1和CDR3(根据IMGT编码)的各有一个Cys，这增加的2个半胱氨酸会显著增加二硫键错配的几率，导致错误折叠；并且这增加的2个半胱氨酸形成的一对二硫键会使得其跟人抗体差异增大，免疫原性风险可能增加。众所周知，与人源序列差异越大，通俗地说人源化程度越低，潜在免疫原性越高，那么在用于人体时，人体产生抗VHH抗体的可能性越高。生物药物的免疫原性高低，往往决定了其临床应用的有效性和安全性，是其能否成功开发用于临床的一个关键。本专利技术的一个重要贡献是筛选获得了一些既高亲和力，但是又非常接近人源抗体结构的VHH序列。

技术实现思路

[0004]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种抗人PD-L1纳米抗体，用于解决现有技术中的问题。
[0005]为实现上述目的及其他相关目的，在本专利技术的第一方面，提供一种抗PD-L1纳米抗体，其互补决定区CDR包括氨基酸序列如下所示的CDR1～CDR3：(1)SEQ ID NO:6所示的CDR1，SEQ ID NO:15所示的CDR2，SEQ ID NO:25所示的CDR3；或(2)SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:26所示的CDR3；或(3)SEQ ID NO:8所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:27所示的CDR3；或(4)SEQ ID NO:9所示的CDR1，SEQ ID NO:17所示的CDR2，SEQ ID NO:28所示的CDR3；或(5)SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:29所示的CDR3；或(6)SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:18所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3。
[0006]在一个优选例中，所述抗PD-L1纳米抗体还分别包括框架区FR，所述框架区FR包括氨基酸序列如下所示的FR1～FR4：(1
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)SEQ ID NO:1所示的FR1，SEQ ID NO:11所示的FR2，SEQ ID NO:19所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4；或(2
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)SEQ ID NO:2所示的FR1，SEQ ID NO:12所示的FR2，SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗PD-L1纳米抗体，其互补决定区CDR包括氨基酸序列如下所示的CDR1～CDR3：(1)SEQ ID NO:6所示的CDR1，SEQ ID NO:15所示的CDR2，SEQ ID NO:25所示的CDR3；或(2)SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:26所示的CDR3；或(3)SEQ ID NO:8所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:27所示的CDR3；或(4)SEQ ID NO:9所示的CDR1，SEQ ID NO:17所示的CDR2，SEQ ID NO:28所示的CDR3；或(5)SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:29所示的CDR3；或(6)SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:18所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3。2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗PD-L1纳米抗体还分别包括框架区FR，所述框架区FR包括氨基酸序列如下所示的FR1～FR4：(1
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)SEQ ID NO:1所示的FR1，SEQ ID NO:11所示的FR2，SEQ ID NO:19所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4；或(2
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)SEQ ID NO:2所示的FR1，SEQ ID NO:12所示的FR2，SEQ ID NO:20所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4；或(3
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)SEQ ID NO:3所示的FR1，SEQ ID NO:13所示的FR2，SEQ ID NO:21所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4；或(4
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)SEQ ID NO:4所示的FR1，SEQ ID NO:13所示的FR2，SEQ ID NO:22所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4；或(5
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)SEQ ID NO:5所示的FR1，SEQ ID NO:12所示的FR2，SEQ ID NO:23所示的FR3，SEQ ID NO:32所示的FR4；或(6
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)SEQ ID NO:5所示的FR1，SEQ ID NO:14所示的FR2，SEQ ID NO:24所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4。3.如权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗PD-L1纳米抗体包括：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:33～38任一所示的纳米抗体；或(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:33～38任一所示序列具有80％以上相同性、且具有(a)纳米抗体功能的纳米抗体。4.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗PD-L1纳米抗体为人源化的抗体，较佳地，其框架区FR包括选自下组的氨基酸序列的FR1～FR4：SEQ ID NO:3所示的FR1；SEQ ID NO:59～61所示的FR2；SEQ ID NO:62～64所示的FR3；SEQ ID NO:65所示的FR4。5.如权利要求1或4所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗PD-L1纳米抗体为人源化抗体，包括：(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:39～44任一所示的纳米抗体；或(ii)氨基酸序列与SEQ ID NO:39～44任一所示序列具有80％以上相同性、且具有(i)纳米抗体功能的纳米抗体。6.一种融合蛋白，包括：第一结构域，其为权利要求1～4任一所述的纳米抗体；以及第二结构域，其具有延长体内半衰期作用和/或...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚高峰，周振兴，陈永露，杨志愉，董佳里，温晓芳，黄岩山，
申请(专利权)人：浙江道尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：