多功能抗体、其制备及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种通过基因工程技术获得的靶向PD-1同时具有IL-15/IL-15Rα复合物的生物学效应的多功能抗体，并公开了编码所述抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体、包含所述重组载体的重组细胞以及所述多功能抗体的制备方法及其医药用途。所述多功能抗体可有效地解决单靶点抗体药物的耐药和复发，同时降低有效剂量，更加有效地杀伤肿瘤细胞，延长原位肿瘤模型动物的存活期；且较IL-15或IL-15/IL-15受体复合物而言，延长了血清半衰期并提高了肿瘤靶向性，降低其毒副作用。降低其毒副作用。降低其毒副作用。

【技术实现步骤摘要】
多功能抗体、其制备及其用途


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及靶向PD-1同时具有IL-15/IL-15Rα复合物的生物学效应的多功能抗体、编码所述抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体、包含所述重组载体的重组细胞以及所述多功能抗体的制备方法及其医药用途。

技术介绍

[0002]程序性细胞死亡蛋白1(programmedcelldeathprotein1,PD-1)及其受体PD-L1、PD-L2是T细胞活性的重要调节因子。T细胞表面的PD-1与其他细胞表面的PD-L1/2的结合造成对T细胞的抑制，这在人体避免自身免疫疾病和产生免疫耐受的过程中起到重要作用。肿瘤细胞利用PD-1/PD-L1检查点这种免疫系统保护自我的调节机制，通过在肿瘤细胞自身或肿瘤微环境表达PD-L1/2，与T细胞表面的PD-1结合，传递负信号，导致T细胞功能衰退及耗竭，达到抑制免疫应答、肿瘤逃逸的目的。因此，通过抗体(抗PD-1抗体或抗PD-L1/2抗体)对二者的结合进行抑制，可以有效解除肿瘤微环境中的免疫抑制，使T细胞重新活化杀伤肿瘤。
[0003]尽管肿瘤免疫对于肿瘤的治疗取得了突破性进展，但研究表明PD-1抑制剂对于PD-L1过表达肿瘤患者的反应率仅有20％，而对于PD-L1阴性患者的反应率仅为9％。PD-1抑制剂对于肿瘤的杀伤依赖于肿瘤微环境中免疫细胞的浸润，然而肿瘤微环境长期处于免疫抑制状态，其环境中的免疫细胞浸润减少，即使抗PD-1抗体解除了肿瘤微环境中的免疫抑制，仍没有免疫细胞对肿瘤细胞进行杀伤。此外，肿瘤微环境中免疫细胞缺少和用药后免疫细胞的衰竭是PD-1抗体耐药和复发的主要机制。
[0004]细胞因子(cytokine,CK)属于免疫调节分子，根据其性质、给药浓度和活性发挥部位的不同，对免疫系统具有一定的激活或者抑制作用。白细胞介素15(interleukin-15,IL-15)是Grabstein等人于1994年发现的一种分子量约为12-14kD的细胞因子，可在机体正常的免疫应答中发挥作用，如促进T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞的增殖，增加免疫细胞的活性。IL-15属于γc细胞因子，为4-α螺旋超家族细胞因子。IL-15主要表达于单核细胞或巨噬细胞，另外人长期骨髓基质细胞培养上清中也含有IL-15。IL-15需通过与其受体结合发挥生物学活性。IL-15受体由三个受体亚基组成：IL-15受体α(IL-15Rα)、IL-2受体β(IL-2Rβ，也称IL-15Rβ或CD122)和γc(也称CD132)。IL-15Rα内含一个sushi结构域，能与IL-15结合，并且是使结合后的IL-15发挥生物学功能所必需的。在与受体结合后，IL-15可通过信号传导促进NK细胞和T细胞的增殖和活化，维持肿瘤相关抗原记忆T细胞的存活性。
[0005]由于IL-15特异性受体IL-15α的存在，IL-15不引起所活化的T细胞的凋亡，不诱导抑制性T细胞上调，更加有效地激活CD8+T细胞和NK细胞，且具有记忆功能。因此，在免疫调节最具活性的细胞因子中，IL-15具有接到针对多种肿瘤类型和病毒感染(包括HIV、HBV、HCV、LCMV等)的免疫的许多重要方面的独特能力。
[0006]然而，细胞因子在临床上的使用存在着单药给药靶向性差的缺点，只有高浓度给药才可以达到抗肿瘤作用，而高浓度给药会产生免疫抑制作用和高毒性。并且，非靶向性细
胞因子对于免疫系统的激活是系统性的，免疫系统被广泛的激活，具有致命的副作用。此外，由于细胞因子属于小分子量蛋白，不具备抗体的体内循环保护机制，单纯的细胞因子往往半衰期较短，需要短时间重复高剂量给药。目前临床研究药物多采用PEG化或者Fc融合来提高细胞因子的半衰期，虽然半衰期得以延长，但仍无法解决细胞因子的靶向性差的问题。
[0007]肿瘤的发生和发展都伴随着对免疫系统的入侵，免疫功能不全的个体常常有较高的癌症发生率和较差的预后。因此研究者投入了大量的时间精力提高癌症患者的免疫功能，包括给予免疫刺激性的细胞因子治疗，如IFN、IL-2和IL-15等；利用树突细胞为基础的疫苗来激活免疫系统以提高内源性免疫反应；利用自体癌症特异性细胞毒性T细胞激活和扩增的过继细胞转移治疗；或者改造T细胞使其表达嵌合抗原受体用以识别肿瘤细胞特异性抗原等。
[0008]通过信号抑制减少PD-1表达可以与抗PD-1治疗联合，将PD-1/PD-L1通路控制在低水平可以显著增加治疗效果，因此免疫治疗和靶向治疗可以联合应用。目前已在多种小鼠肿瘤模型中验证了NK细胞和T细胞，尤其是细胞毒性T细胞在肿瘤免疫过程中的作用。多个临床试验正在评估某些细胞因子单用，或者与多种化疗药物和肿瘤靶向的单克隆抗体和其他细胞因子联用的抗癌疗效。但是，诸如IL-15等细胞因子存在的高剂量用药下的毒性以及半衰期短而导致的短时间重复给药问题仍然存在，成为联用策略的一大制约因素。

技术实现思路

[0009]为了克服现有技术的不足，提高单抗疗效，改善肿瘤预后，兼具良好的成药性，本专利技术公开了通过基因工程技术获得的靶向PD-1同时具有IL-15/IL-15Rα复合物的生物学效应的多功能抗体，并公开了编码所述抗体的核酸分子、包含所述核酸分子的重组载体、包含所述重组载体的重组细胞以及所述多功能抗体的制备方法及其医药用途。本专利技术具体包括以下几个方面：
[0010]本专利技术的第一方面涉及一种多功能抗体，其特征在于，其包括第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链，所述第一重链的一部分和第一轻链的一部分、所述第二重链的一部分和第二轻链的一部分分别配对，且二者之一或全部形成PD-1抗原结合位点，此外所述第一重链还包含细胞因子IL-15片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第二重链还包含IL-15受体片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第一重链中的细胞因子IL-15片段与第二重链中的IL-15受体片段相互结合。
[0011]进一步地，所述第一重链和第二重链的免疫球蛋白Fc部分选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4的恒定区氨基酸序列，优选IgG1或IgG4的恒定区氨基酸序列。
[0012]进一步地，所述第一重链和第二重链的Fc部分还包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸替换(根据EU编号系统编号)：S228P、L234F、L235E、P331S、D356K、T366W、K392D、D399K、Y407A、和K409D，优选包含S228P、T366W、Y407A。
[0013]进一步地，所述第一重链中的IL-15片段和第二重链中的IL-15受体片段可以分别嵌合于所述链的Fc部分内部，也可以存在于Fc部分外部，优选位于所述相应重链的CH1和CH2功能区之间。
[0014]进一步地，所述多功能抗体的第一重链中的IL-15片段、第二重链中的IL-15受体片段各自单独或与额外的连接肽一起共价结合于所述链中；所述连接肽包含甘氨酸(G)和
丝氨酸(S)残基，优选包含GGGGS重复，更优选包含1-2个GGGGS重复。
[001本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多功能抗体，其特征在于，其包括第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链，所述第一重链的一部分和第一轻链的一部分、所述第二重链的一部分和第二轻链的一部分分别配对，且二者之一或全部形成PD-1抗原结合位点，所述第一重链还包含细胞因子IL-15片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第二重链还包含IL-15受体片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第一重链中的细胞因子IL-15片段与第二重链中的IL-15受体片段相互结合。2.如权利要求1所述的多功能抗体，其中所述第一重链和第二重链的免疫球蛋白Fc部分选自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4的恒定区氨基酸序列。3.如权利要求2所述的多功能抗体，其中所述第一重链中的IL-15片段和第二重链中的IL-15受体片段分别嵌合于所述重链的Fc部分内部，或存在于Fc部分外部。4.如权利要求3所述的多功能抗体，其中所述第一重链中的IL-15片段和第二重链中的IL-15受体片段分别嵌合于所述相应重链的CH1和CH2功能区之间。5.如权利要求1所述的多功能抗体，其中所述多功能抗体的第一重链中的IL-15片段、第二重链中的IL-15受体片段各自单独或与额外的连接肽一起共价结合于所述链中；所述连接肽包含甘氨酸(G)和丝氨酸(S)残基。6.如权利要求5所述的多功能抗体，所述连接肽包含GGGGS重复。7.如权利要求1所述的多功能抗体，其中所述多功能抗体的第一重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组；所述多功能抗体的第二重链氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成的组；所述多功能抗体的第一轻链和第二轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7。8.如权利要求7所述的多功能抗体，其中所述多功能抗体的第一重链为SEQ ID NO:1，第二重链为SEQ ID NO:4，第一轻链和第二轻链(二者相同)为SEQ ID NO:7。9.如权利要求7所述的多功能抗体，其中所述多功能抗体的第一重链为SEQ ID NO:2，第二重链为SEQ ID NO:5，第一轻链和第二轻链(二者相同)为SEQ ID NO:7。10.如权利要求7所述的多功能抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜晓玲，姜东成，吴崇兵，
申请(专利权)人：盛禾中国生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：