包含重组人凝血因子Xa蛋白的异质性群体的组合物制造技术

本公开内容提供了包含人凝血因子Xa(FXa)的重组变体的组合物。这样的组合物包含FXa的多种同工型和翻译后修饰且可用于治疗需要止血的受试者。

【技术实现步骤摘要】
包含重组人凝血因子Xa蛋白的异质性群体的组合物本申请是申请日为2014年9月16日、专利技术名称为“包含重组人凝血因子Xa蛋白的异质性群体的组合物”的中国专利技术专利申请201480052212.2的分案申请。相关申请的交叉参考本申请要求2013年9月24日提交的美国临时申请号61/881,834(其全文以引用方式并入本文)的权益。序列表的参考根据37CFR§1.821，以计算机可读形式(CRF)经由EFS-Web随本文同时提交的文件名为PC72049_SEQLIST_ST25.txt的序列表以引用方式并入本文。所述序列表的电子复本在2014年9月10日创建，文件大小为31千字节。专利技术背景对于能够在一系列其中无法通过医疗或外科干预适当地控制出血的临床病况中控制过量出血的有效疗法是有需求的。此种未被满足的需求在患有血友病的患者，尤其是在那些由于产生抑制性抗体而使因子替代疗法的有效性减小的患者中是特别关键的。经活化的凝血因子X(FXa)在内因性和外因性凝血通路会聚处的凝血级联中占据中心位置。与膜结合的FXa在其辅因子Va(FVa)的存在下将凝血酶原转化成凝血酶，该凝血酶活化血小板并将纤维蛋白原转化成纤维蛋白以形成血栓。原则上，直接施用FXa的替代疗法可以矫正出血。然而，由于FXa的血浆半衰期非常短且可能因其它凝血因子的活化而引起过度凝血，所以其治疗潜力受到限制。早期的工作鉴定出一种FXa变体(I16L变体)，其中亮氨酸取代野生型FXa重链的氨基末端处的异亮氨酸(在胰凝乳蛋白酶编号方案中的位置16)。所述取代产生具有酶原样特征的FXa变体。Toso,R.等人，TheconformationalswitchfromthefactorXzymogentoproteasestatemediatesexositeexpressionandprothrombinaseassembly.J.Biol.Chem.283.18627-18635(2008)；IvanciuL.等人，Azymogen-likefactorXavariantcorrectsthecoagulationdefectinhemophilia.Nat.Biotechnol.29:1028-33(2011)。当不与其辅因子Va(FVa)掺入凝血酶原酶复合物中时，FXaI16L变体不具有显著的催化活性并且与野生型FXa相比，受到较好的保护而免于被血清蛋白酶抑制剂去活化。因此，与野生型FXa相比，该变体具有较长的血清半衰期。然而，与凝血酶原酶中的FVa结合导致该变体从酶原样状态转换至活性构象，从而恢复该变体催化凝血酶原转化成凝血酶的能力并从而恢复其促凝血活性。在血友病A和血友病B的小鼠模型中，在受伤前施用FXaI16L变体在截割尾巴后以剂量依赖方式减少失血。这些实验的结果表明FXaI16L变体可用于治疗人血友病患者中不受控制的出血。然而，在早期研究中所使用的FXaI16L变体从经稳定转染的HEK293细胞小量制造，再使用鲁塞尔氏蝰蛇毒蛋白酶(Russell'svipervenomprotease)RVVX活化FX蛋白。Toso,R.,Zhu,H.&Camire,R.M.TheconformationalswitchfromthefactorXzymogentoproteasestatemediatesexositeexpressionandprothrombinaseassembly.J.Biol.Chem.283,18627-18635(2008)。虽然对于小规模的研究是有用的，但此方法不适合用于大量制造临床研究和最终供给病人所需的经纯化的FXa变体蛋白。因此，本领域需要制备FXaI16L变体蛋白，所制造的量和纯度使FXaI16L变体蛋白可在临床试验中进行测试且被批准后可提供给需要止血的受试者。专利技术概述本公开内容通过提供FXa变体蛋白的组合物来解决上述本领域中未被满足的需求，所述FXa变体蛋白以足够的纯度和数量制造而能提供给需要止血的受试者。在多个实施方案中，这些组合物包含FXa变体蛋白的不同的同工型和翻译后修饰。在一个实施方案中，组合物包含FXa变体蛋白的β型，其中轻链和重链蛋白序列分别由下列组成：SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至139和146至386、氨基酸1至140和146至384、氨基酸1至140和146至386、氨基酸1至141和146至384、氨基酸1至141和146至386、氨基酸1至142和146至384、氨基酸1至142和146至386、氨基酸1至143和146至384、以及氨基酸1至143和146至386、所有氨基酸。在另一个实施方案中，组合物包含FXa变体蛋白的α型，其中轻链和重链蛋白序列分别由下列组成：SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至139和146至398、氨基酸1至140和146至398、氨基酸1至140和146至399、氨基酸1至141和146至398、氨基酸1至141和146至399、氨基酸1至142和146至398、以及氨基酸1至142和146至399、所有氨基酸。在上述的FXa变体蛋白的任一个或多个β和α同工型实施方案中，所述蛋白的轻链可经修饰以包含β-羟基Asp63、O-连接的己糖和9、10或11个Gla残基。在一些实施方案中，存在9个Gla残基。在其它实施方案中，存在10个Gla残基。在其它实施方案中，存在11个Gla残基。在上述的FXa变体蛋白的任一个或多个β同工型实施方案中，重链可经修饰以包含一或两个核心-1O-连接的聚糖。在一些实施方案中，仅第一个、仅第二个或两个核心-1O-连接的聚糖可以是未经唾液酸化、经单唾液酸化或经二唾液酸化的。根据一些实施方案，不存在唾液酸基团。在其它实施方案中，存在一个唾液酸基团。在其它实施方案中，存在两个唾液酸基团。在进一步的实施方案中，存在三个唾液酸基团。在更一步的实施方案中，总共存在四个唾液酸基团。根据一些实施方案，FXa变体蛋白组合物包含本公开内容的表2所列的至少一种FXa变体蛋白种类。在其它实施方案中，本公开内容的组合物包含表2所列出的FXa变体蛋白种类的至少5种、至少10种、至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50、至少55种或至少60种。根据其它实施方案，FXa变体蛋白组合物包含至少一种其中轻链为本公开内容的表3所列出的种类的FXa变体蛋白。且在其它实施方案中，FXa变体蛋白组合物包含至少一种其中重链为本公开内容的表4所列出的种类的FXa变体蛋白。在一些实施方案中，本公开内容的任一种或多种FXa变体蛋白可以以相对于可能存在的其它种类而改变的平均丰度存在于组合物中。例如，相较于存在的其它种类，特定的种类可以以主要丰度、次要丰度或微量丰度存在。或者，相较于存在的其它种类，特定的种类可以以高丰度、中等丰度、低丰度或非常低的丰度存在。本公开内容还提供了用于制造和纯化FXa变体蛋白的核酸、载体、宿主细胞和方法。例如，包括了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，其包含至少一种选自由下列所组成的群组的FXa变体蛋白的β型：/n其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸1至139和146至386组成的FXa变体蛋白，/n其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸1至140和146至384组成的FXa变体蛋白，/n其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸1至140和146至386组成的FXa变体蛋白，/n其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸1至141和146至384组成的FXa变体蛋白，/n其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸1至141和146至386组成的FXa变体蛋白，/n其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸1至142和146至384组成的FXa变体蛋白，/n其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸1至142和146至386组成的FXa变体蛋白，/n其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸1至143和146至384组成的FXa变体蛋白，和/n其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸1至143和146至386组成的FXa变体蛋白。/n...

【技术特征摘要】
20130924 US 61/881,8341.一种组合物，其包含至少一种选自由下列所组成的群组的FXa变体蛋白的β型：
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至139和146至386组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至140和146至384组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至140和146至386组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至141和146至384组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至141和146至386组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至142和146至384组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至142和146至386组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至143和146至384组成的FXa变体蛋白，和
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至143和146至386组成的FXa变体蛋白。


2.一种组合物，其包含至少一种选自由下列所组成的群组的FXa变体蛋白的α型：
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至139和146至398组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至140和146至398组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至140和146至399组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至141和146至398组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至141和146至399组成的FXa变体蛋白，
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至142和146至398组成的FXa变体蛋白，和
其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至142和146至399组成的FXa变体蛋白。


3.一种包含FXa变体蛋白的组合物，其中所述FXa变体蛋白选自表2所列的FXa变体蛋白种类。


4.一种包含FXa变体蛋白的组合物，其中所述FXa变体蛋白的轻链选自表3所列的轻链种类。


5.一种用于纯化因子Xa(FXa)变体蛋白的方法，其包含下述步骤：
(i)将混合模式色谱(MMC)介质与含有FXa变体蛋白的经过滤的细胞培养基接触，
(ii)洗脱与所述MMC色谱介质结合的FXa变体蛋白，
(iii)将阴离子交换色谱介质与步骤(ii)中洗脱的FXa变体蛋白接触，
(iv)洗脱与所述阴离子交换色谱介质结合的FXa变体蛋白，
(v)将阳离子交换色谱介质与步骤(iv)中洗脱的FXa变体蛋白接触；和
(vi)洗脱与所述阳离子交换色谱介质结合的FXa变体蛋白。


6.一种组合物，其包含两种或更多种选自由下列所组成的群组的重组FXa变体蛋白：
(a)其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至139和146至386组成的重组FXa变体蛋白，
(b)其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至140和146至386组成的重组FXa变体蛋白，
(c)其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至141和146至386组成的重组FXa变体蛋白，
(d)其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至142和146至386组成的重组FXa变体蛋白，
(e)其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至143和146至386组成的重组FXa变体蛋白，
(f)其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至140和146至384组成的重组FXa变体蛋白，
(g)其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的氨基酸序列的氨基酸1至141和146至384组成的重组FXa变体蛋白，
(h)其中轻链和重链蛋白序列分别由SEQIDNO：1的...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·A·扬科斯基，K·A·约翰逊，W·C·皮阿森扎，J·C·罗斯，M·沙马施金，P·J·夏泊，M·B·斯威泽，S·B·韦斯顿，
申请(专利权)人：辉瑞大药厂，
类型：发明
国别省市：美国;US