一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr制造技术

本发明专利技术涉及一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr(A570T)，核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑4，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。本发明专利技术在由酶原状态活化成为具有活性的酶后对其生理抑制物产生抵抗，因此具有很高的凝血活性，对非生理性底物具有更强的催化能力，应用于出血性疾病的治疗，具有很好的基因治疗、基因编辑与重组蛋白替代治疗前景。

【技术实现步骤摘要】
一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr
本专利技术属于出血病治疗领域，特别涉及一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr。
技术介绍
凝血因子缺陷或其它人体凝血功能障碍时会导致出血性疾病的发生，其中由于凝血因子VIII/IX(FVIII/FIX)缺陷所导致的出血性疾病称之为血友病(甲型/乙型)，重型病人的凝血因子VIII/IX活性往往低于正常的1％，经常发生自发的出血导致肌肉血肿或者关节畸形。输注因子VIII/IX制剂(目前通常是体外重组表达的凝血因子VIII/IX蛋白)补充患者体内的凝血因子VIII/IX水平是目前唯一有效的治疗方法，但是需要频繁的给药。基因治疗是目前正在临床试验的治疗方法，将正常的凝血因子VIII/IX基因导入患者体内表达，从而达到提高凝血因子VIII/IX水平，预防出血的目的。虽然应用重组或血浆来源的FVIII/FIX可以有效地治疗血友病A和B，但是约有30％的病人在治疗后产生抗体，使治疗失效。旁路凝血活性药物是治疗有抑制物产生血友病患者的最佳选择。但是目前临床上应用的凝血因子VIIa(FVIIa)，由于半寿期短(～2小时)，所需剂量大(90～100μg/kg体重)，治疗成本高昂，因此如何获得具有更好治疗效果和药物代谢特点的新型旁路凝血途径药物是目前血友病治疗的一个亟待解决的问题。凝血因子IX是凝血因子XI(FXI)的生理性底物，凝血因子XI的凝血活性主要与其高效裂解活化凝血因子IX的能力有关。但是凝血反应中的其它组分也可能会被凝血因子XI所催化裂解。近年研究表明，凝血因子XI可以催化凝血因子V(FV)和凝血因子X(FX)活化，从而越过凝血因子IX直接激活凝血共同途径；另外一项研究还表明，凝血因子XI可以降解组织因子途径抑制物(TFPI)，从而延长外源途径活化凝血因子FVII(FVIIa)的作用时间，间接地放大外源途径激活的凝血反应。但是野生型凝血因子XI催化裂解包括FX,FV或TFPI在内的旁路凝血反应底物的效率非常低下，限制了它通过旁路促进凝血反应的能力。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr(A570T)，该突变体在由酶原状态活化成为具有活性的酶后对其生理抑制物产生抵抗，因此具有很高的凝血活性，对非生理性底物具有更强的催化能力，应用于出血性疾病的治疗，具有很好的基因治疗、基因编辑与重组蛋白替代治疗前景。本专利技术提供了一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr：(1)核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；或(2)核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；或(3)核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；或(4)核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；或是任意其他核苷酸在1708位、1709位和1710位突变的组合。本专利技术还提供了一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr的突变蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，该突变体位于570的氨基酸为Thr(记为Ala570Thr)而非人野生型FXI(hFXI)的Ala；或是任意其他氨基酸在该位点的改变。本专利技术还提供了一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr的突变蛋白的核酸，或与所述编码核酸长度相同且与所述编码核酸完全互补的核酸。本专利技术还提供了一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr的突变蛋白的载体。本专利技术还提供了一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr的突变蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)将高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr的编码基因连入载体中，得到重组载体；(2)将上述重组载体转化宿主细胞，得到表达重组凝血因子XIAla570Thr突变细胞克隆；(3)于无血清培养基中连续灌流培养上述重组细胞克隆，诱导重组凝血因子XIAla570Thr的突变蛋白的表达；(4)分离纯化、过滤，最后灌装、冻干，得到所表达的高活性凝血因子XIAla570Thr突变蛋白。所述步骤(3)中的无血清培养基为“SAFCBiosciencesEX-CELLTM302”(商品化的试剂)。所述步骤(4)中的纯化包括初纯和精纯。本专利技术还提供了一种表达突变蛋白Ala570Thr的质粒载体进行基因转导，其制备和检验包括如下步骤：将编码高活性凝血因子XIAla570Thr的cDNA连接入含CMV或其他真核细胞表达启动子(具有或不具有肝组织特异性)的基因表达质粒。所述高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr的突变蛋白应用于制备基因治疗药物。所述高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr的突变蛋白应用于制备血友病或其他出血性疾病的重组蛋白治疗药物。所述高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr的突变蛋白应用于制备凝血因子XI突变体Ala570Thr突变体融合蛋白，并将其施用于血友病或其他出血性疾病的重组蛋白治疗药物。所述融合蛋白为人白蛋白、免疫球蛋白Fc、转铁蛋白或alpha1抗胰蛋白酶。本专利技术的核酸或氨基酸序列的药物组合物或基因治疗载体，用于预防和/或治疗疾病，其中所述疾病主要包括出血性疾病或各种原因导致的出血；其中，最可能的出血性疾病是血友病A和B，即由于遗传性凝血因子VIII或IX缺乏导致的出血性疾病，并包括其中有抑制性抗体产生的血友病A和B，或者后天因抑制物产生所导致的获得性凝血因子VIII或IX缺乏；及其它使用旁路制剂的出血性疾病，例如新生儿凝血障碍；严重的肝脏疾病；高风险手术；创伤性失血；骨髓移植；血小板减少症和血小板功能障碍；口服抗凝的紧急逆转；先天性凝血因子V，VII，X和XI的缺陷；血管性血友病，及血管性血友病因子抑制物导致的获得性血管性血友病，与大量损伤有关的失血，大脑出血，血小板功能障碍。有益效果与凝血因子XI突变体Gly397Ser由酶原转化成为具有催化活性的酶的速度加快为主的提升凝血因子XI凝血活性机制不同，本专利技术中的凝血因子XI突变体Ala570Thr在由酶原状态活化成为具有活性的酶(活化的凝血因子XI，FXIa)后对其生理抑制物(如proteasenexinII/KPI等)产生抵抗，因此具有很高的凝血活性，对非生理性底物具有更强的催化能力，从而增强了旁路途径凝血活性，通过不依赖于凝血因子IX(FIX)/凝血因子VIII(FVIII)的机制高效的通过旁路途径激活凝血反应，提升机体整体凝血功能，应用于出血性疾病的治疗，具有很好的基因治疗与重组蛋白替代治疗前景。附图说明图1-图5为本专利技术高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr(即A570T)的核酸与编码蛋白的序列示意图；图6为本专利技术载体结构的示意图；图7为本专利技术高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr活性示意图；图8为本专利技术高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr体外纠正凝血因子VIII缺陷富血小板血浆凝血酶生成示意图；图9为血栓弹力图检测凝血因子XI突变体Ala570Thr纠正含抗凝血因子V本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr，其特征在于：/n(1)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；/n或(2)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；/n或(3)核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；/n或(4)核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；/n或是任意其他核苷酸在1708位、1709位和1710位突变的组合。/n

【技术特征摘要】
1.一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr，其特征在于：
(1)核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；
或(2)核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；
或(3)核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；
或(4)核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；
或是任意其他核苷酸在1708位、1709位和1710位突变的组合。


2.一种如权利要求1所述的高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr的突变蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO:5所示，该突变体位于570的氨基酸为Thr而非人野生型FXI的Ala；或是任意其他氨基酸在该位点的改变。


3.编码如权利要求2中所述的突变蛋白的核酸，或与所述编码核酸长度相同且与所述编码核酸完全互补的核酸。


4.一种表达如权利要求2中所述的突变蛋白的载体。


5.一种高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr的突变蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)将如权利要求1所述的高活性凝血因子XI突变体Ala570Thr的编码基因连入载体中，得到重组载体；
(2)将上述重组载体转化宿主细胞，得到表达重组凝血因子XIAla570Thr突变细胞克隆；
(3)于无血清培养基中连续灌流培养上述重组细胞克隆，诱导重...

【专利技术属性】
技术研发人员：武文漫，王学锋，丁秋兰，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，武文漫，王学锋，丁秋兰，
类型：发明
国别省市：上海;31