生产天麻素的重组大肠杆菌、构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种生产天麻素的重组大肠杆菌、构建方法及应用，生产天麻素的重组大肠杆菌，其特征在于包括外源基因：4CL基因、CCR基因、CAR基因、Sfp基因和ugt73b6

【技术实现步骤摘要】
生产天麻素的重组大肠杆菌、构建方法及应用
本专利技术属于生物工程
，具体地，涉及一种辅酶A依赖型羧酸还原途径在催化天麻素合成中的应用。
技术介绍
天麻是兰科植物天麻(GastrodiaelataBl.)的茎块，为常用名贵中药。植物天麻生于疏林下，林中空地、林缘，灌丛边缘，海拔400-3200米，已被世界自然保护联盟(IUCN)评为易危物种，并被列入《濒危野生动植物物种国际贸易公约》(CITES)的附录Ⅱ中，同时也被列入中国《国家重点保护野生植物名录(第二批)》中，为Ⅱ级保护植物。其根茎入药用以治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿惊风癫痫抽搐等症。另据研究表明，天麻还具有刺激神经系统、健脑、延缓衰老、增强机体免疫力和预防骨质疏松等作用。天麻的主要药用活性成分是天麻素及其苷元对羟基苄醇等。近年来，以天麻素作为主要原料生产的药剂和食品等产品种类越来越多，其苷元对羟基苄醇是一种具有重要工业价值的酚类化合物，对羟基苄醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体。人们对天麻素及其苷元对羟基苄醇的关注程度不断提高，但至今未有植物中天麻素合成通路的相关报道。天麻素(Gastrodin,GAS)具有以下特征：化学名称为4-(hydroxymethyl)phenylbeta-D-glucopyranoside，分子式为C13H18O7，分子量为286.1053，CAS号为62499-27-8，结构式为其苷元对羟基苄醇(4-Hydroxybenzylalcohol，4-HBAl)具有以下特征：化学名称为p-Hydroxybenzylalcohol，分子式为C7H8O2，分子量为124.0524，CAS号为623-05-2，结构式为目前，天麻素的生产主要是通过化学合成及对天麻植株进行萃取。化学合成法从前体开始需要多步反应，且副产物多、反应专一性差，另外该过程中需要使用毒性较强的溴素、红磷等物质造成了严重的三废问题；植株萃取法存在含量太低，资源浪费、成本高、破坏生态环境等缺陷，比如西藏波密县仿野生种植天麻的天麻素含量在0.41-2.28g/kg，其平均含量为0.88g/kg，而野生天麻的天麻素含量不到其四分之一。除化学合成和植株萃取外，微生物转化及组织培养生产天麻素也是研究热点。白艳芬等在大肠杆菌中引入分支酸丙酮酸裂解酶ubiC、诺卡氏菌属来源的羧酸还原酶NiCAR、自枯草芽孢杆菌的辅因子Sfp、植物红景天中的糖基转移酶突变体UGT73B6FS结合其内源醇脱氢酶ADHs，创建了一条起始于莽草酸途径，经由对羟基苯甲酸，通过羧酸还原、醛还原和糖基化的合成通路，首次实现了以葡萄糖为原料微生物从头合成天麻素。(BaiYF,YinH,BiHP,ZhuangYB,LiuT,MaYH.DenovobiosynthesisofGastrodininEscherichiacoli[J].Metab.Eng.,2016,35:138-147)。已申请的相关专利(专利申请号：20150264006.4)利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途，其中对羟基苄醇的产量可达240mg/L，天麻素的产量可达265mg/L。为满足工业生产的需求，其产量仍需要进行进一步的提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种能提高天麻素产量的生产天麻素的重组大肠杆菌。本专利技术的第二个目的是提供一种生产天麻素的重组大肠杆菌的构建方法。本专利技术的第三个目的是提供一种生产天麻素的重组大肠杆菌的用途。本专利技术的技术方案概述如下：一种生产天麻素的重组大肠杆菌，包括外源基因：4CL基因、CCR基因、CAR基因、Sfp基因和ugt73b6MKFA基因。优选地，所述4CL基因是GenBank:X13325.1；所述CCR基因是GenBank:AF332459.1；所述CAR基因的核苷酸序列用SEQIDNo：1所示；所述Sfp基因来自中国专利申请号：20150264006.4；利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途；所述ugt73b6MKFA基因来自中国专利申请号：201711482080.4，一种糖基转移酶突变体及其在催化天麻素生物合成中的应用。所述4CL基因、CCR基因、CAR基因、Sfp基因和ugt73b6MKFA基因被包含在重组质粒中。重组质粒为第一重组质粒和第二重组质粒，所述4CL基因、CCR基因被包含在第一重组质粒中，所述CAR基因、Sfp基因和ugt73b6MKFA基因被包含在第二重组质粒中。第一重组质粒为pCDFDuet-4CL-CCR；所述第二重组质粒为pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6MKFA。ubiC基因来源于大肠杆菌BL21(DE3)，GenBank:AAY88959.1。一种生产天麻素的重组大肠杆菌的构建方法，是在大肠杆菌中同时引入质粒pCDFDuet-4CL-CCR和pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6MKFA。上述重组大肠杆菌在生产天麻素中的应用。上述应用包括如下步骤：使用上述重组大肠杆菌，在葡萄糖存在下，发酵，诱导基因的表达，获得含天麻素的发酵产物。本专利技术的优点：本专利技术在以葡萄糖为原料微生物从头合成天麻素通路中，首次引入辅酶A依赖型还原途径，构建了一种催化合成天麻素的大肠杆菌重组菌株，其产量高于已有相关专利(专利申请号：20150264006.4)利用葡萄糖生产对羟基苄醇或天麻素的重组大肠杆菌及用途。附图说明图1为本专利技术的重组大肠杆菌生物合成对羟基苄醇、天麻素的途径示意图，其中：Glucose为葡萄糖；G6P为磷酸-6-葡萄糖；DAHP为3-脱氧-D阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸；CHA为分支酸，4-HBAc为对羟基苯甲酸，4-HBDe为对羟基苯甲醛，4-HBAl为对羟基苄醇，4-HBCoA为对羟基苯甲酰辅酶A，GAS为天麻素。图2为重组菌株的发酵产物以及对羟基苄醇和天麻素标准品的HPLC结果，其中，1是菌株BL21(DE3,pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6MKFA)的发酵产物,2是菌株BL21(DE3,pCDFDuet-4CL-CCR和pETDuet-ubiC-CAR-Sfp-ugt73b6MKFA)的发酵产物，3是对羟基苄醇和天麻素的标准品，峰Ⅰ为对羟基苄醇峰，峰Ⅱ为天麻素峰。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。本专利技术中，羧酸还原酶CAR(GenBank:WP_007468889.1)为酪氨酸合成对羟基苄醇过程中的相关酶，本专利技术使用的是Segniliparaceae菌属，还可以选用其它菌属。基因4CL(GenBank:X13325.1)和CCR(GenBank:AF332459.1)为肉桂醇及其衍生物形成过程中的相关基因，可以来自植物欧芹和拟南芥，参照专利(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产天麻素的重组大肠杆菌，其特征在于包括外源基因：4CL基因、CCR基因、CAR基因、Sfp基因和ugt73b6

【技术特征摘要】
1.一种生产天麻素的重组大肠杆菌，其特征在于包括外源基因：4CL基因、CCR基因、CAR基因、Sfp基因和ugt73b6MKFA基因。


2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于所述4CL基因是GenBank:X13325.1；所述CCR基因是GenBank:AF332459.1；所述CAR基因的核苷酸序列用SEQIDNo：1所示；所述Sfp基因来自中国专利申请号：20150264006.4；所述ugt73b6MKFA基因来自中国专利申请号：201711482080.4。


3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于所述4CL基因、CCR基因、CAR基因、Sfp基因和ugt73b6MKFA基因被包含在重组质粒中。


4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组质粒为第一重组质粒和第二重组质粒，所述4CL基因、CCR基因被包含在第一重组质粒中，所述CAR基因、Sfp基因和ugt73b6MKFA...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘涛，薛雅鞠，刘畅，庄以彬，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12