一种特异去除砷的工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物法除砷技术领域，具体涉及一种特异去除砷的工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术提供的工程菌包含砷结合蛋白表达盒，该表达盒包含砷诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因、荧光蛋白基因和砷结合蛋白基因。该工程菌可受砷的诱导将具有砷结合活性的砷结合蛋白在细菌表面高效表达，无需额外添加诱导剂，能特异结合砷，还可根据荧光信号监测砷结合蛋白的表达。本发明专利技术提供的特异去除砷的工程菌为环境中砷污染物的治理提供了新方法，同时，本发明专利技术的工程菌对于利用金属特异诱导启动子和相应金属特异调控蛋白构建具有去除特异金属功能的工程菌提供了一种新的思路、手段和资源，在去除环境中非金属和金属污染物方面具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种特异去除砷的工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及生物法除砷
，具体涉及一种特异去除砷的工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
目前环境污染的修复方法主要有物理化学方法和生物方法，前者是利用物理化学手段将环境中的污染物移除或将其转变为稳定无害物质的方法，后者则是利用生物体或生物体内某些组分的特性将环境中的污染物去除的方法。利用表达金属结合蛋白的细菌对金属离子的吸附能力能够实现金属离子的去除。目前，关于金属结合蛋白基因工程菌的研究或局限于构建非特异性金属结合基因工程菌(对多种金属离子都具有吸附作用)，或在表达金属结合蛋白时往往需要添加诱导剂，或对金属的结合、吸附能力有限。对多种重金属离子的同时吸附不利于对吸附重金属的回收利用；诱导剂的添加不仅增加了经济成本，而且有些诱导剂(如IPTG)本身也具有一定的毒性；金属的结合能力有限导致金属去除或回收效率较低。砷及其化合物是常见的环境污染物，环境中的砷和砷化物污染物可通过水、大气和食物等途径进入人体，造成危害。对环境污染物具有特异响应的启动子和能够与环境污染物特异结合的蛋白的发现为构建对污染物有特异吸附作用的工程菌提供了可能性。在此基础上，构建无需特异添加诱导剂即可对砷发挥特异性吸附作用的工程菌具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异去除砷的工程菌，本专利技术的另一目的是提供该菌株的构建方法和应用。为实现上述目的，本专利技术利用基因重组技术将砷结合蛋白基因和细菌表面展示载体蛋白基因克隆至砷诱导启动子的下游，构建了由砷调控可表面表达砷结合蛋白的表达盒；将该表达盒转入宿主菌构建了对砷有特异吸附作用的工程菌。当环境中存在砷时，该工程菌不需要添加额外的诱导剂就可以表达砷结合蛋白并特异吸附去除砷。在该工程菌的基础上，进一步在砷结合蛋白表达盒中引入荧光蛋白基因，使得能够根据荧光信号监测砷结合蛋白的表达情况。本专利技术的砷结合蛋白表达盒中包含细菌表面展示载体蛋白、荧光蛋白和砷结合蛋白的融合蛋白，融合蛋白中的各蛋白质要发挥正常的功能，均需要有正常的蛋白结构，然而融合蛋白中各蛋白之间的表达和折叠多存在不可预知的相互影响，进而影响融合蛋白中的某个或某几个蛋白的表达量和正确折叠。本专利技术在构建包含细菌表面展示载体蛋白、荧光蛋白和砷结合蛋白的融合蛋白和表达盒时，发现选择不同的启动子、砷结合蛋白以及细菌表面展示载体蛋白进行组合，得到表达盒的砷结合蛋白的表面表达效果存在较大差异，经过大量的筛选和比对，本专利技术确定了能够同时保证砷结合蛋白在细菌表面大量、正确表达的表达盒结构和序列。具体地，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术首先提供一种工程菌，包含金属或非金属结合蛋白表达盒，所述表达盒包含金属诱导启动子或非金属诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因、金属结合蛋白基因或非金属结合蛋白基因。所述金属为镉、锌、铅、铜、镍，所述非金属为砷。进一步地，本专利技术提供一种特异去除砷的工程菌，其包含砷结合蛋白表达盒，所述表达盒包含砷诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因和砷结合蛋白基因。以上所述的砷结合蛋白优选来源于大肠杆菌基因组或大肠杆菌R因子R773质粒、荧光假单胞菌MSP3的基因组、铜绿假单胞菌基因组的砷结合蛋白。优选地，本申请实施例提供了以上所述的砷诱导启动子，分别为实施例中Pars1(包括操纵基因即调控区序列、启动子序列、调控基因即编码能与砷特异结合的转录阻遏蛋白基因序列，共492bp)，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，和Pars2(包括操纵基因即调控区序列、启动子序列、调控基因即编码能与砷特异结合的转录阻遏蛋白基因序列，共451bp)，其核苷酸序列如SEQNO.2所示。作为本专利技术的一种实施方式，所述砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。作为本专利技术的另一种实施方式，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。作为本专利技术的一种优选实施方式，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。携带该表达盒的工程菌具有更优的砷结合蛋白表面表达和砷结合活性，且在高砷浓度条件下(例如：砷浓度≥40μmol/L或砷浓度≥160μmol/L)的砷吸附活性更优。本专利技术所述的细菌表面展示载体蛋白为选自冰核蛋白、Lpp-OmpA、OmpC中的一种。优选为冰核蛋白(INP)N端结构域。为便于监测砷结合蛋白的表达情况，本专利技术所述的表达盒还包含荧光蛋白基因。优选地，所述表达盒沿5’至3’方向依次包括砷诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因、荧光蛋白基因和砷结合蛋白基因。本专利技术所述的表达盒优选具有如SEQIDNO.5～7任一所示的序列。其中，如SEQIDNO.5所示序列的第1位至492位为砷诱导启动子系统序列，第599位至1171位为冰核蛋白N端结构域序列，第1178位至1885位为荧光蛋白基因序列，第1892位至2245位为砷结合蛋白序列。如SEQIDNO.6所示序列的第1位至451位为砷诱导启动子系统序列，第560位至1132位为冰核蛋白N端结构域序列，第1139位至1846位为荧光蛋白基因序列，第1853位至2206位为砷结合蛋白序列。如SEQIDNO.7所示序列的第1位至492位为砷诱导启动子序列，第599位至1171位为冰核蛋白N端结构域序列，第1178位至1885位为荧光蛋白基因序列，第1892位至2245位为砷结合蛋白序列。本专利技术所述的表达盒还可包含位于砷结合蛋白基因下游的转录终止子。所述转录终止子优选为rrnBT1T2。以上所述的表达盒可插入所述工程菌的基因组中，或插入质粒载体中独立复制和遗传。针对上述表达盒，本专利技术对与之适配的、能够实现砷结合蛋白的细菌表面的高效、正确表达的宿主菌进行了筛选。优选地，本专利技术所述工程菌为含有携带所述表达盒的载体的大肠杆菌(Escherichiacoli)。所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21菌株。以上所述的表达盒插入的质粒载体可为pUC系列载体、pBR322系列载体或pACYC系列载体。本专利技术还提供所述特异去除砷的工程菌的构建方法：将所述表达盒或携带所述表达盒的载体导入宿主菌中得到。本专利技术提供含有所述的工程菌的制剂。本专利技术所述的制剂可为液体制剂或固体制剂，为将所述工程菌加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。本专利技术还提供所述工程菌或所述制剂在去除或回收金属或非金属元素中应用，或在治理环境中金属或非金属元素污染中的应用。优选地，本专利技术提供所述工程菌或所述制剂在去除砷或回收砷中的应用，或在治疗环境中砷污染中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过将细菌表面展示载体蛋白-荧光蛋白-砷结合蛋白的融合蛋白基因置于砷诱导启动子下游，构建了由砷调控的可将砷结合蛋白在细菌表面表达且具有荧光特性的砷结合蛋白的表达盒、载体和工程菌。该工程菌不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程菌，其特征在于，包含金属或非金属结合蛋白表达盒，所述表达盒包含金属诱导启动子或非金属诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因、金属结合蛋白基因或非金属结合蛋白基因；优选所述金属为镉、锌、铅、铜、镍，所述非金属为砷。/n

【技术特征摘要】
1.一种工程菌，其特征在于，包含金属或非金属结合蛋白表达盒，所述表达盒包含金属诱导启动子或非金属诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因、金属结合蛋白基因或非金属结合蛋白基因；优选所述金属为镉、锌、铅、铜、镍，所述非金属为砷。


2.一种特异去除砷的工程菌，其特征在于，包含砷结合蛋白表达盒，所述表达盒包含砷诱导启动子、细菌表面展示载体蛋白基因和砷结合蛋白基因；所述砷结合蛋白为来源于大肠杆菌基因组或大肠杆菌R因子R773质粒、荧光假单胞菌MSP3的基因组或铜绿假单胞菌基因组的砷结合蛋白；
和/或，所述砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQNO.2所示。


3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；或者，
所述砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；或者，
所述砷诱导启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述砷结合蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.根据权利要求1～3任一项所述的工程菌，其特征在于，所述细菌表面展示载体蛋白为选自冰核蛋白、Lpp-O...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琴，伍一军，杨文耀，王菲菲，车飞，张艳平，王海燕，王宗爽，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11