一种产L-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种对谷氨酸棒杆菌中NCgl1089基因编码序列引入点突变或改善其表达的方法，所述方法可以使带有所述突变的菌株提高L‑赖氨酸的发酵产量。所述点突变是使NCgl1089基因序列第508位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，使编码的相应氨基酸序列第170位谷氨酸(E)被赖氨酸(K)所取代。

【技术实现步骤摘要】
一种产L-赖氨酸的重组菌株及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及一种具有增强的L-赖氨酸生产能力的棒杆菌属的菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
L-赖氨酸具有促进发育、增强免疫力和提高中枢神经组织功能等生理功效，是人体和动物不能自身合成且生长必需的8种基本氨基酸之一。目前，L-赖氨酸是世界上的第二大氨基酸品种，主要生产方法是发酵法，其中谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)等是赖氨酸的重要生产菌株。L-赖氨酸工业产量的约90％用作饲料工业中的营养强化剂，10％用作食品工业中的鲜味剂和甜味剂，以及医药行业中的药物中间体。对发酵法生产L-赖氨酸的改进可以涉及发酵技术如搅拌和供应氧气；或涉及营养培养基的组成，例如发酵过程中的糖浓度；或涉及将发酵液加工成合适的产品形式，例如通过干燥和造粒发酵液或离子交换色谱；或可以涉及相关微生物本身的固有性能性质。用于改善这些微生物的性能性质的方法包括是诱变、突变体的选择和筛选。以这种方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于具有调节重要性的代谢物是营养缺陷型并产生L-赖氨酸。
技术实现思路
本专利技术提供了生成L-赖氨酸的属于棒杆菌属的微生物，其中编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达改善。本专利技术还提供了通过使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法。本专利技术的第一个方面提供了生成L-赖氨酸的属于棒杆菌属的微生物，其具有编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达。根据本专利技术，所述改善的表达是所述多核苷酸表达增强，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。所述SEQIDNO:3的氨基酸序列是基因NCgl1089编码的蛋白。所述微生物与野生型或亲本菌株相比具有增强的L-赖氨酸生产能力。所述多核苷酸可以编码与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有约90％或更高、约92％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高、或约99％或更高的序列同源性的氨基酸序列。如本文中使用的，术语“同源性”指两种多核苷酸或两种多肽模块之间的百分比同一性。可以通过使用本领域中已知的方法测定一种模块和另一种模块之间的序列同源性。例如，可以通过BLAST算法测定此类序列同源性。可以如下增强多核苷酸的表达：通过取代或突变表达调节序列、对多核苷酸序列引入突变、通过经由染色体插入或载体导入的多核苷酸拷贝数的增加、或其组合等。可以修饰多核苷酸的表达调节序列。表达调节序列控制与其可操作连接的多核苷酸的表达，并且例如可以包括启动子、终止子、增强子、沉默子等。多核苷酸可以具有起始密码子的变化。可以将多核苷酸掺入染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本文，特定的位点可以包括例如转座子位点或基因间位点。另外，可以将多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。在本专利技术的一种实施方式中，通过将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而增加拷贝数。在本专利技术的一种实施方式中，通过将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入微生物染色体的特定位点中，从而过表达所述核酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，将多核苷酸或者具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而增加拷贝数。在本专利技术的一种实施方式中，将带有启动子序列的多核苷酸或者带有启动子序列的具有点突变的多核苷酸掺入表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中，从而过表达所述核酸序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述多核苷酸可以包含SEQIDNO:1的核苷酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的具有点突变，使得SEQIDNO:3的氨基酸序列的第170位谷氨酸被不同的氨基酸所取代。根据本专利技术，优选第170位谷氨酸被赖氨酸所取代。根据本专利技术，SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，其中第170位谷氨酸(E)被赖氨酸(K)所取代后的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。在本专利技术的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第508位碱基发生突变而形成的。根据本专利技术，所述突变包括SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第508位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)。在本专利技术的一个实施方式中，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQIDNO:2所示的多核苷酸序列。如本文中使用的，术语“可操作连接”指调节序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，由此调节序列控制多核苷酸序列的转录和/或翻译。调节序列可以是能提高多核苷酸的表达水平的强启动子。调节序列可以是源自属于棒杆菌属的微生物的启动子或者可以是源自其它微生物的启动子。例如，启动子可以是trc启动子、gap启动子、tac启动子、T7启动子、lac启动子、trp启动子、araBAD启动子或cj7启动子。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述启动子是编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸(NCgl1089基因)的启动子。如本文中使用的，术语“载体”指含有基因的调节序列和基因序列并且配置为在合适的宿主细胞中表达靶基因的多核苷酸构建体。或者，载体又可以指多核苷酸构建体，其含有可用于同源重组的序列，从而由于对宿主细胞导入的载体，可以改变宿主细胞的基因组中的内源基因的调节序列，或者可以将可以表达的靶基因插入宿主的基因组的特定位点中。在这点上，本专利技术中使用的载体可以进一步包含选择标志物以确定载体对宿主细胞的导入或者载体对宿主细胞的染色体的插入。选择标志物可以包含赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养缺陷型、针对细胞毒剂的抗性、或表面蛋白的表达的标志物。在用此类选择剂处理的环境中，由于仅表达选择标志物的细胞可以存活或者显示不同表型性状，可以选择经转化的细胞。在本专利技术的一些具体实施方式中，使用的载体是pK18mobsacB质粒，pXMJ19质粒。如本文中使用的，术语“转化”指将多核苷酸导入宿主细胞中，从而多核苷酸可以作为基因组外元件或者以插入宿主细胞的基因组中能复制。转化本专利技术中使用的载体的方法可以包括将核酸导入细胞的方法。另外，如相关技术中公开的，可以根据宿主细胞实施电脉冲方法。根据本专利技术，属于棒杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)。在本专利技术的一个实施方案中，所述属于棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌YP97158，保藏编号：CGMCCNo.12856，保藏日期：2016年8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生成L-赖氨酸的属于棒杆菌属的微生物，其特征在于，具有编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达；/n优选，所述改善的表达是编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。/n

【技术特征摘要】
1.一种生成L-赖氨酸的属于棒杆菌属的微生物，其特征在于，具有编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的改善的表达；
优选，所述改善的表达是编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的表达增强，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变，或者编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸具有点突变且表达是增强的。


2.如权利要求1所述的微生物，其特征在于，编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸的点突变，使得SEQIDNO:3的氨基酸序列的第170位谷氨酸被不同的氨基酸所取代；优选第170位谷氨酸被赖氨酸所取代。


3.如权利要求1-2任一项所述的微生物，其特征在于，编码SEQIDNO:3的氨基酸序列的多核苷酸包含SEQIDNO:1的核苷酸序列。


4.如权利要求1-3任一项所述的微生物，其特征在于，所述具有点突变的多核苷酸序列是由SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第508位碱基发生突变而形成的；
优选，所述突变包括SEQIDNO:1所示多核苷酸序列第508位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)；
优选，所述具有点突变的多核苷酸序列包括SEQIDNO:2所示的多核苷酸序列。

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【专利技术属性】
技术研发人员：魏爱英，孟刚，贾慧萍，周晓群，马风勇，赵春光，田斌，郭小炜，
申请(专利权)人：宁夏伊品生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏;64