提高链霉菌聚酮化合物产量的方法技术

本发明专利技术涉及提高链霉菌聚酮化合物产量的方法。具体而言，通过在稳定期强化链霉菌中三酰甘油分解通路，能够大幅提高链霉菌产聚酮化合物的能力。

【技术实现步骤摘要】
提高链霉菌聚酮化合物产量的方法
本专利技术涉及微生物工程领域。更具体而言，本专利技术通过提高处于发酵稳定期的工程化的链霉菌(Streptomyces)中三酰甘油(TAG)的分解，提高工程菌聚酮化合物的产量。
技术介绍
聚酮化合物是生物体合成的一类次级代谢产物，它们通常为具有很高生物活性的有机物。很多临床使用的抗生素、免疫抑制剂、抗寄生虫剂、抗肿瘤剂等药物均为天然合成或衍生的聚酮化合物。工业链霉菌是发酵生产聚酮化合物的最主要的工程菌。在发酵初期，细菌消耗外部营养从而快速生长。而当必需营养物变得有限，特别是培养基中的碳源几乎被耗尽时，链霉菌从初级代谢切换至次级代谢(NieseltK.等，BMCGenomics11，10，2010)，开始合成次级代谢产物(例如聚酮化合物)(BibbM.J等，CurrOpinMicrobiol8,208-215，2005；AlamM等，BMCGenomics11，202，2010)。虽然本领域对聚酮的生物合成途径及其调控通路的研究已取得巨大进展，然而，外源碳源被消耗后聚酮合成通路所使用的碳源，即胞内直接前体物质来源仍然未知。
技术实现思路
本专利技术首次对聚酮化合物生物合成过程中的碳代谢流进行动态分析，提出可对处于稳定期的链霉菌内的三酰甘油(TAG)分解途径进行强化，来提高聚酮化合物的产量。在第一方面，本专利技术提供了一种提高链霉菌中聚酮化合物产量的方法，所述方法包括对处于稳定期的所述链霉菌内的TAG分解途径进行强化。在第二方面，本专利技术提供了一种在链霉菌中将初级代谢切换至次级代谢的方法，所述方法包括对所述链霉菌中的TAG分解途径进行强化。在第三方面，本专利技术提供了一种用于发酵生产聚酮化合物的链霉菌，其中，比起出发菌株，所述链霉菌中的催化β-氧化途径不可逆反应的至少一个酶的表达水平和/或活性增强。在第四方面，本专利技术提供了第三方面所述的链霉菌在发酵生产聚酮化合物方面的用途。有益效果大多数微生物在营养物质耗尽时开启次级代谢。因此，更好地理解次级代谢的开启和切换途径(例如，从胞外碳源切换到胞内碳源)对基于次级代谢的发酵工程而言具有重要意义。就利用链霉菌发酵生产抗生素而言，外部营养耗尽后聚酮化合物生物合成的直接碳源一直是未知的。本研究的实验结果证实了细胞内TAG池为稳定期聚酮生物合成提供前体(即，提供碳源)，并调节代谢流去向。具体而言，由于TAG分解经由脂肪酸β-氧化过程产生大量还原力NADH，较高的还原力抑制了TCA循环中的柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶的活性，从而降低了乙酰CoA节点的代谢流流向TCA，因此增强流向聚酮生物合成。这与之前研究中报道的，TAG途径仅是聚酮化合物生物合成的竞争途径(Craney,A.等，ChemBiol19,1020-1027(2012)；Zabala,D.等，MetabEng20,187-197(2013))完全不同。虽然本领域已经揭示了从初级代谢到次级代谢的切换时转录谱发生改变(Nieselt,K.等，BMCGenomics11,10(2010)；Liu,G.等，MicrobiolMolBiolRev77,112-143(2013)；Bibb,M.J.等，CurrOpinMicrobiol8,208-215(2005))，然而还不能解释稳定期初级代谢酶活降低(翻译后水平)的现象。我们的研究发现，稳定期的高NADH/NAD+比能够抑制柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶，进而导致进入TCA循环的碳流减少。特别地，专利技术人发现，鉴于β-氧化提供大量的还原当量(NADH和FADH)，该高NADH/NAD+比主要是由于TAG分解造成。因此，稳定期TAG的分解具有双重作用：不仅为聚酮化合物的合成提供前体(碳源)和能量(还原力)，而且对碳流的重新分配起到调节作用。本专利技术的结果给出了整个发酵过程中碳代谢流动态改变的基本机制，并提出在链霉菌中从初级代谢到次级代谢切换的新机制。基于这一机制，本专利技术提出通过对TAG分解进行时程(temporal)调控来提高工程链霉菌聚酮化合物的产量。如实施例所证明的，本专利技术的调控方法在链霉菌中具有广泛适用性：实验室水平下天蓝色链霉菌产放线紫红素(actinorhodin)产量提高了190％，委内瑞拉链霉菌产杰多霉素B(jadomycinB)产量提高了170％，龟裂链霉菌土霉素(oxytetracycline)产量提高了47％至9.17g/L；而在工业发酵规模下阿维菌素B1a产量提高了50％，达到9.31g/L，这是目前所报道的工业规模所能实现的最高产量。本专利技术提出的增强稳定期TAG分解的策略为聚酮化合物的发酵改进提供了新的方案。附图说明图1为利用时程比较代谢组学(time-coursecomparativemetabolome)对代谢物池进行分析的结果。(a)初级代谢和次级代谢切换的示意图，显示在不同时间聚酮产量、菌体生物量和液体培养基中碳源量的趋势。(b)天蓝色链霉菌M145和HY01发酵过程中葡萄糖消耗、菌体生物量和放线紫红素(Act)产量随时间的变化。(c)通过GC-MS分析对M145的代谢物进行识别和分类。TCA：三羧酸循环；NUM：核苷酸代谢；FMM：果糖和甘露糖代谢；EMP：糖酵解；AAM：氨基酸代谢；GM：半乳糖代谢；GDM：乙醛酸和二羧酸代谢；PPP：戊糖磷酸途径；LPM：脂质代谢；PGI：戊糖和葡糖醛酸相互转化。(d)M145中不同代谢通路代谢物水平随时间的变化。以20h的代谢物量进行归一化。通过t检验分析显著性(p值<0.05表明具有统计显著性，该显著水平为***p<0.001，**p<0.01以及*p<0.05，ns表示没有显著性)。(e)M145中磷脂(PL)和TAG水平随时间的变化。以20h的量进行归一化。(f)培养48小时的M145菌体中TAG不同脂肪酸部分的占比。TAG-iC13:0：异十三烷酸酯；TAG-aiC13:0：反异十三烷酸酯(anteisotridecanoate)；TAG-iC14:0：异肉豆蔻酸酯；TAG-C14:0，肉豆蔻酸酯；TAG-iC15:0：异十五烷酸酯；TAG-aiC15:0：反异十五烷酸酯(anteisopentadecanoate)；TAG-C15:0：十五烷酸酯；TAG-iC16:0：异棕榈酸酯；TAG-C16:0：棕榈酸酯；TAG-iC17:0：异十七烷酸酯；TAG-aiC17:0：反异十七烷酸酯(anteisomargarate)；TAG-C17:0：十七烷酸酯；TAG-C18：硬脂酸酯；TAG-C16:1-Δ9：9-十六碳烯酸；TAG-C18:1-Δ9：9-十八碳烯酸。(b)结果以三次独立重复实验的平均值和s.d.给出，(d)和(e)的结果以五次独立重复实验的平均值和s.d.给出。图2证明胞内TAG池在生长稳定期对聚酮生物合成的贡献。(a)48-96h菌株M145和HY01胞内TAG池不同脂肪酸部分的浓度变化。(b)对于M145和HY01，在稳定期胞内浓度差异最显本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高链霉菌中聚酮化合物产量的方法，所述方法包括对处于稳定期的所述链霉菌内的三酰甘油分解途径进行强化。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高链霉菌中聚酮化合物产量的方法，所述方法包括对处于稳定期的所述链霉菌内的三酰甘油分解途径进行强化。


2.一种在链霉菌中将初级代谢切换至次级代谢的方法，所述方法包括对所述链霉菌中的三酰甘油分解途径进行强化。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立新，王为善，李珊珊，李子龙，谭高翼，范可强，张敬宇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，华东理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11