一株刺激免疫反应的幽门螺杆菌突变菌及构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一株刺激免疫反应的幽门螺杆菌突变菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术提供的突变菌株不含编码O抗原合成过程中糖基转移酶的基因futB，同时改造lipid A结构，敲除相关合成基因lpxE和lpxF，其菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2020028。其能够高效刺激宿主产生免疫反应并分泌外膜囊泡，使幽门螺杆菌外膜囊泡具有疫苗效力高的特性。同时本发明专利技术方法能够有效的使幽门螺杆菌lipid A重新被TLR4识别，并能够使lipid A具有佐剂活性，能够更好的为抗原递呈服务。本发明专利技术可用于构建新颖的幽门螺杆菌抗原递呈质粒，通过不同的策略将抗原蛋白递呈至细菌周质或者暴露于细菌外膜表面，从而提高目的抗原被宿主识别产生免疫反应的效率。

【技术实现步骤摘要】
一株刺激免疫反应的幽门螺杆菌突变菌及构建方法和应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一株刺激免疫反应的幽门螺杆菌突变菌及构建方法和应用。
技术介绍
幽门螺杆菌(H.pylori，简称Hp)是一种微需氧的革兰氏阴性细菌，能够在人的胃及十二指肠等区域终身持续存在，它会引起胃黏膜轻微的慢性发炎，严重者甚至导致胃及十二指肠溃疡与胃癌。幽门螺杆菌感染是人中最常见的细菌感染性疾病，全球有一半以上人口感染有幽门螺杆菌。这种感染与许多胃疾病，例如慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌或胃部癌症和黏膜相关性淋巴样组织(mucosaassociatedlymphoidtissue，MALT)淋巴瘤相关。现阶段，最常用到的防治幽门螺杆菌感染的方法是抗生素治疗。尽管在一些临床实验中，抗生素治疗表现出了积极的效率，但遇到复杂的临床病症时仍有很大的局限性。抗生素治疗的策略已经显现出了一定的缺陷，例如：1)抗生素耐药菌株的出现会阻碍抗生素治疗，在一些地区，抗生素耐药性的发生会达到50％以上；2)长期服用抗生素会导致毒副反应，例如腹痛、恶心和腹泻等；3)在药物治疗过本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株刺激免疫反应的幽门螺杆菌突变菌，其特征在于，所述突变菌不含编码O抗原合成过程中糖基转移酶的基因futB，同时改造lipid A结构，敲除相关合成基因lpxE和lpxF。/n

【技术特征摘要】
1.一株刺激免疫反应的幽门螺杆菌突变菌，其特征在于，所述突变菌不含编码O抗原合成过程中糖基转移酶的基因futB，同时改造lipidA结构，敲除相关合成基因lpxE和lpxF。


2.根据权利要求1所述的刺激免疫反应的幽门螺杆菌突变菌，其特征在于，所述突变菌株的分类命名为：Helicobacterpylori，其命名为：HelicobacterpyloriLQ001(ΔfutBΔlpxEΔlpxF)，保藏编号为CCTCCNO：M2020028，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址：中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2020年1月9日。


3.根据权利要求1所述的刺激免疫反应的幽门螺杆菌突变菌，其特征在于，所述futB基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述lpxE基因的核苷酸序列为如SEQIDNo.2所示，所述lpxF基因的核苷酸序列为如SEQIDNo.3所示。


4.一株刺激免疫反应的幽门螺杆菌突变菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
1)通过同源重组的方法，敲除幽门螺杆菌编码O抗原合成过程中糖基转移酶的基因futB；
2)改造lipidA结构，通过同源重组的方法，敲除相关合成基因lpxE和lpxF。


5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)和2)所示的同源重组方法包括如下步骤：
1)构建同源重组质粒PI11570-futB、PI11570-lpxE和PI11570-lpxF；
2)制备幽门螺杆菌26695菌株感受态；
3)将步骤1)所得同源重组质粒通过电转的方式转化入幽门螺杆菌26695菌株感受态中，将电转杯移入电转仪，2500伏电击4毫秒；
4)将电转杯中的液体转移至不含抗生素的幽门螺杆菌固体培养基上，微氧环境下培养48小时，传代至含有相应抗生素的培养基上培养48小时，再传至抗性培养基中培养48小时后，产生的单克隆即为电转成功的菌；
5)通过PCR筛选得到不含futB、lpxE和lpxF的突变菌株，记为ΔfutBΔlpxEΔlpxF。


6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中幽门螺杆菌26695感受态的制备方法包括如下步骤：
1)将H.pylori26695培养36-48h至对数期，取事先在冰上预冷过的电转液3ml于培养皿内，收集菌体1ml于洁净的1.5ml离心管中，使菌浓度调整为5*109CFU/ml；
2)6000rpm于4℃低温离心5min，重复洗涤三次；
3)弃上清后将菌体重悬于预冷的1ml电转液中，将菌浓度调整为5*108CFU/ml，即制备好感受态备用。


7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述同源重组质粒PI11570-futB的构建步骤为：
1)引物设计：
futBleft-up：5’GCTGCAGCTTTAGCCATTGCGGGTTTG3’
futBleft-down:5’CGGAATTCCGggtcatgaccccatttatgaatg3’
futBright-up:5’CGGGATCCCGgatgtggcgtagtctcagg3’
fu...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘琼，黄孝天，李标先，曾令兵，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36