一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程领域。本发明专利技术通过基因同源重组技术，将铜绿假单胞菌酰基载体蛋白编码基因Pa acpP用大肠杆菌酰基载体蛋白编码基因Ec acpP替换，使得突变菌株产生绿脓菌素的能力提升为野生型菌株的4～5倍。为构建及选育生产绿脓菌素或其相关次生代谢产物，如吩嗪‑1‑羧酸的基因工程菌和大规模生产绿脓菌素及其相关次生代谢产物提供了工程菌种。

【技术实现步骤摘要】
一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
绿脓菌素(Pyocyanin,PYO)是铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)分泌的一种具有氧化还原能力的吩嗪类毒力因子，可溶解于氯仿、甲醇以及水中。绿脓菌素存在氧化态和还原态两种形式，氧化态在碱性时呈蓝色，在酸性时呈红色；还原态无色，但在酸性条件下为氧化还原的中间阶段，呈绿色。其不同离子形式之间的转换可干扰细胞内氧化还原反应，影响胞内生物大分子的功能。绝大多数野生分离的铜绿假单胞菌菌株均可产生绿脓菌素，但产量较低。作为一种毒力因子，绿脓菌素可以与细胞膜呼吸链相互作用，导致细菌无法进行代谢转运，并且会加速细菌耗氧，产生H2O2并转移电子流，最终使得细胞死亡。有研究表明，绿脓菌素可抑制金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和肺炎克雷伯菌等致病菌的生长；对烟曲霉、白色念珠菌和酵母菌等真菌也有拮抗效果。而绿脓菌素的前体——吩嗪-1-羧酸，更是作为一种农用杀菌剂被加以推广。因此，绿脓菌素作为一种潜在新型的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产绿脓菌素的铜绿假单胞菌工程菌，其特征在于，所述工程菌是铜绿假单胞菌酰基载体蛋白编码基因Pa acpP的突变菌株，命名为PA-A1；其中，所述酰基载体蛋白编码基因Pa acpP被替换为大肠杆菌酰基载体蛋白基因Ec acpP。/n

【技术特征摘要】
1.一种高产绿脓菌素的铜绿假单胞菌工程菌，其特征在于，所述工程菌是铜绿假单胞菌酰基载体蛋白编码基因PaacpP的突变菌株，命名为PA-A1；其中，所述酰基载体蛋白编码基因PaacpP被替换为大肠杆菌酰基载体蛋白基因EcacpP。


2.一种如权利要求1所述的高产绿脓菌素的铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于，铜绿假单胞菌酰基载体蛋白编码基因被替换为大肠杆菌酰基载体蛋白编码基因。


3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)构建携带大肠杆菌EcacpP基因的重组质粒：根据PaacpP序列、其上下游DNA序列以及大肠杆菌EcacpP序列设计引物P1-P8；以铜绿假单胞菌PAO1总DNA为模板，分别以P1/P2，P3/P4引物扩增得到PaacpP基因的上下游各500bp片段，再以大肠杆菌MG1655菌株总DNA作为模板，以P5/P6引物扩增获得EcacpP基因，利用重叠延伸PCR方法，以P1/P6为引物将PaacpP的上游和下游片段与大肠杆菌EcacpP基因拼接起来，将重叠延伸后的DNA片段用限制性核酸内切酶HindIII和BamHI消化后，连接至以相同内切酶消化过的pK18mobsacB，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR筛选，获得阳性克隆；
(2)获得敲除质粒：利用试剂盒提取上述阳性克隆中的EcacpP基因重组质粒，并测定其DNA序列；使用限制性核酸内切酶BamHI线性化EcacpP基因重组质粒，纯化备用；再提取p34S-Gm质粒，用BamHI消化后获得庆大霉素抗药性基因(GmR)，将线性化EcacpP基因重组质粒与GmR基因连接获得敲除质粒pPA-A1；
(3)铜绿假单胞菌突变菌株的构建与鉴定：将测序无误后的pPA-A1转化至大肠杆菌S17-1菌株；通过接合作用，质粒pPA-A1转移进入铜绿假单胞菌细胞中，并发生同源重组；将接合产物涂布于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海洪，张文彬，马金成，曹丹，宋雨露，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44