一种利用核酮糖单磷酸途径和丝氨酸循环途径协同同化甲醇的重构甲基工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种利用核酮糖单磷酸途径和丝氨酸循环途径协同同化甲醇的重构甲基工程菌及其应用，属于基因工程技术领域；所述重构甲基工程菌的宿主菌包括天然利用丝氨酸循环途径同化甲醇的甲基营养菌；所述重构甲基工程菌中导入的外源基因包括己酮糖‑6‑磷酸合成酶的编码基因和己酮糖‑6‑磷酸异构酶的编码基因。本发明专利技术以甲醇作为唯一碳源和能源且以天然利用丝氨酸循环途径同化甲醇的甲基营养菌作为出发宿主，在出发宿主中引入异源表达编码己酮糖‑6‑磷酸合成酶的基因hps和异源表达编码己酮糖‑6‑磷酸异构酶的基因phi，实现核酮糖单磷酸途径的构建，从而利用核酮糖单磷酸途径和丝氨酸循环途径协同同化甲醇。

【技术实现步骤摘要】
一种利用核酮糖单磷酸途径和丝氨酸循环途径协同同化甲醇的重构甲基工程菌及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种利用核酮糖单磷酸途径和丝氨酸循环途径协同同化甲醇的重构甲基工程菌及其应用。
技术介绍
甲基营养菌(Methylotrophs)是一类能够以甲烷、甲醇、甲酸、甲铵等有机碳作为唯一碳源和能源生长的细菌。目前根据甲基营养菌同化代谢途径不同，分为两种主要类型，一种是利用核酮糖单磷酸途径(Ribulosemonophosphatepathway)同化有机碳一中间代谢物甲醛的甲基营养菌(如：BacillusmethanolicusMGA3，MethylobacillusflagellatusKT，MethylococcuscapsulatusBath)，同化过程生成的C6中间代谢物(如：果糖-6-磷酸)通过ED(EntnerDoudoroffpathway)途径和糖酵解途径(Glycolysis，又称EMP途径)转化成C3中间代谢物(如：丙酮酸)；另一种是利用丝氨酸循环途径(Serinecycle)同化有机碳一中间代谢物甲酸的甲基营养菌(如：MethylorubrumextorquensAM1，MethylosinustrichosporiumOB3b)，该同化过程可以合成C2中间代谢物乙酰辅酶A、C3中间代谢物(如：丝氨酸)和C4中间代谢物(如：苹果酸)。近年针对利用丝氨酸循环同化有机碳(比如甲醇)的甲基营养菌模式菌M.extorquens进行一系列代谢工程改造的研究，实现了催化甲醇转化成2-羟基异丁酸、中康酸、(2S)-甲基琥珀酸、α-蛇麻烯、甲羟戊酸及3-羟基丙酸，但是在摇瓶产量普遍偏低，显著低于以葡糖糖为碳源底物的传统工业菌株(如：大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和酵母菌)的产量。主要原因之一是丝氨酸循环同化甲酸过程中每生成1分子乙酰辅酶A消耗3分子NAD(P)H和3分子ATP，导致其能量转化率低，并且甲酸彻底异化生成二氧化碳的过程会有大量碳外排，这就限制了目标产品的生产能力。相比于丝氨酸循环同化途径，核酮糖单磷酸途径同化甲醛过程每合成1分子的丙酮酸仅消耗1分子ATP，并且产生3分子NAD(P)H。但是，进一步生成乙酰辅酶A的过程，丙酮酸脱羧产生1分子二氧化碳，导致1/3碳量的丢失，而丝氨酸循环同化甲酸生成乙酰辅酶A的过程没有碳丢失。目前，缺少一种能够能够高效同化甲醇的甲基营养菌。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用核酮糖单磷酸途径和丝氨酸循环途径协同同化甲醇的重构甲基工程菌及其应用，本专利技术的重构甲基工程菌能够利用核酮糖单磷酸途径和丝氨酸循环途径协同同化甲醇，能够提高同化效率。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种利用核酮糖单磷酸途径和丝氨酸循环途径协同同化甲醇的重构甲基工程菌，所述重构甲基工程菌的宿主菌包括甲基杆菌MethylorubrumextorquensAM1、甲基杆菌MethylorubrumextorquensPA1或甲烷氧化菌MethylosinustrichosporiumOB3b；所述重构甲基工程菌中导入的外源基因包括己酮糖-6-磷酸合成酶的编码基因和己酮糖-6-磷酸异构酶的编码基因。优选的，所述外源基因以质粒作为载体导入所述宿主菌；所述己酮糖-6-磷酸合成酶的编码基因和己酮糖-6-磷酸异构酶的编码基因串联连接。优选的，所述外源基因还包括磷酸果糖激酶的编码基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因；所述磷酸果糖激酶的编码基因串联于所述己酮糖-6-磷酸异构酶的3’端；所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因串联于所述磷酸果糖激酶的编码基因的3’端。优选的，所述外源基因还包括磷酸果糖激酶的编码基因、转酮酶的编码基因、转醛酶的编码基因和核酮糖磷酸异构酶的编码基因；所述磷酸果糖激酶的编码基因串联于所述己酮糖-6-磷酸异构酶的3’端；所述磷酸果糖激酶的编码基因、转酮酶的编码基因、转醛酶的编码基因和核酮糖磷酸异构酶按照5’到3’的方向依次串联。优选的，所述外源基因还包括磷酸果糖激酶的编码基因、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因和丙二酰辅酶A还原酶的编码基因及其C端；所述己酮糖-6-磷酸合成酶的编码基因、己酮糖-6-磷酸异构酶的编码基因、磷酸果糖激酶的编码基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因导入所述宿主菌的基因组中；所述丙二酰辅酶A还原酶的编码基因及其C端以质粒作为载体导入所述宿主菌。优选的，所述外源基因还包括磷酸果糖激酶的编码基因、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因、2-酮异戊酸脱羧酶的编码基因、醇脱氢酶的编码基因和乙酰乳酸合成酶的编码基因；所述己酮糖-6-磷酸合成酶的编码基因、己酮糖-6-磷酸异构酶的编码基因、磷酸果糖激酶的编码基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因导入所述宿主菌的基因组中；所述2-酮异戊酸脱羧酶的编码基因、醇脱氢酶的编码基因和乙酰乳酸合成酶的编码基因依次串联，并以质粒为载体导入所述宿主菌。优选的，所述己酮糖-6-磷酸合成酶包括第一己酮糖-6-磷酸合成酶、第二己酮糖-6-磷酸合成酶或第三己酮糖-6-磷酸合成酶；所述第一己酮糖-6-磷酸合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示；所述第二己酮糖-6-磷酸合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；所述第三己酮糖-6-磷酸合成酶的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示；所述己酮糖-6-磷酸异构酶包括第一己酮糖-6-磷酸异构酶、第二己酮糖-6-磷酸异构酶或第三己酮糖-6-磷酸异构酶；所述第一己酮糖-6-磷酸异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示；所述第二己酮糖-6-磷酸异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO：5所示；所述第三己酮糖-6-磷酸异构酶的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示。优选的，所述磷酸果糖激酶包括第一磷酸果糖激酶或第二磷酸果糖激酶；所述第一磷酸果糖激酶的氨基酸序列如SEQIDNO：7所示；所述第二磷酸果糖激酶的氨基酸序列如SEQIDNO：8所示。本专利技术提供了上述方案所述重构甲基工程菌在高效同化甲醇中的应用。本专利技术提供了上述方案所述的重构甲基工程菌在制备3-羟基丙酸中的应用。本专利技术提供了上述方案所述的重构甲基工程菌在制备异丁醇中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种利用核酮糖单磷酸途径和丝氨酸循环途径协同同化甲醇的重构甲基工程菌，所述重构甲基工程菌的宿主菌包括天然利用丝氨酸循环途径同化甲醇的甲基营养菌(甲基杆菌MethylorubrumextorquensAM1、甲基杆菌MethylorubrumextorquensPA1或甲烷氧化菌MethylosinustrichosporiumOB3b)；所述重构甲基工程菌中导入的外源基因包括己酮糖-6-磷酸合成酶的编码基因和己酮糖-6-磷酸异构酶的编码基因。本专利技术以甲醇作为唯一碳源和能源以天然利用丝氨酸循环途径同化甲醇的甲基营养菌作为出发宿主，在出发宿主中引入异源表达编码己酮糖-6-磷酸合成酶(Hexulose-6-phosphatesynthase，HPS)的基因hps和异本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用核酮糖单磷酸途径和丝氨酸循环途径协同同化甲醇的重构甲基工程菌，所述重构甲基工程菌的宿主菌包括甲基杆菌Methylorubrum extorquens AM1、甲基杆菌Methylorubrum extorquens PA1或甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b；/n所述重构甲基工程菌中导入的外源基因包括己酮糖-6-磷酸合成酶的编码基因和己酮糖-6-磷酸异构酶的编码基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用核酮糖单磷酸途径和丝氨酸循环途径协同同化甲醇的重构甲基工程菌，所述重构甲基工程菌的宿主菌包括甲基杆菌MethylorubrumextorquensAM1、甲基杆菌MethylorubrumextorquensPA1或甲烷氧化菌MethylosinustrichosporiumOB3b；
所述重构甲基工程菌中导入的外源基因包括己酮糖-6-磷酸合成酶的编码基因和己酮糖-6-磷酸异构酶的编码基因。


2.根据权利要求1所述的重构甲基工程菌，其特征在于，所述外源基因以质粒作为载体导入所述宿主菌；所述己酮糖-6-磷酸合成酶的编码基因和己酮糖-6-磷酸异构酶的编码基因串联连接。


3.根据权利要求2所述的重构甲基工程菌，其特征在于，所述外源基因还包括磷酸果糖激酶的编码基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因；所述磷酸果糖激酶的编码基因串联于所述己酮糖-6-磷酸异构酶的3’端；所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因串联于所述磷酸果糖激酶的编码基因的3’端。


4.根据权利要求2所述的重构甲基工程菌，其特征在于，所述外源基因还包括磷酸果糖激酶的编码基因、转酮酶的编码基因、转醛酶的编码基因和核酮糖磷酸异构酶的编码基因；所述磷酸果糖激酶的编码基因串联于所述己酮糖-6-磷酸异构酶的3’端；所述磷酸果糖激酶的编码基因、转酮酶的编码基因、转醛酶的编码基因和核酮糖磷酸异构酶按照5’到3’的方向依次串联。


5.根据权利要求1所述的重构甲基工程菌，其特征在于，所述外源基因还包括磷酸果糖激酶的编码基因、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因和丙二酰辅酶A还原酶的编码基因及其C端；
所述己酮糖-6-磷酸合成酶的编码基因、己酮糖-6-磷酸异构酶的编码基因、磷酸果糖激酶的编码基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因导入所述宿主菌的基因组中；
所述丙二酰辅酶A还原酶的编码基因及其C端以质粒作为载体导入所述宿主菌。


6.根据权利要求1所述的重构甲基工程菌，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨松，陈文静，袁肖杰，莫旭华，马增新，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37