【技术实现步骤摘要】
一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法及其应用
本专利技术涉及生物工程
和鼠李糖脂生产应用领域，具体为用于铜绿假单胞菌高产单鼠李糖脂的基因改造方法，解决了现有方法通过异源表达rhlAB基因合成单鼠李糖脂产量低和从常规鼠李糖脂产物中提取分离单鼠李糖脂操作繁琐等技术问题，为单鼠李糖脂的应用与研究奠定基础。
技术介绍
鼠李糖脂是主要由铜绿假单胞菌代谢合成的一种生物表面活性剂，因其表/界面活性高、安全无毒、临界胶束浓度低、可生物降解、稳定性高等优势，广泛应用于石油开采、环境污染修复、医药、食品、农业生防控制、堆肥等领域。鼠李糖脂是一系列同系物，由1到2个鼠李糖基和1到2个饱和或不饱和的不同碳链长度的脂肪酸链组成。据报道已发现的不同结构的鼠李糖脂分子有近60种。根据鼠李糖脂分子中鼠李糖基的个数多少，将鼠李糖脂分为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。鼠李糖脂所含鼠李糖基的个数必然影响其理化活性，即单鼠李糖脂和双鼠李糖脂存在活性差异，应用潜力也不同。研究表明单鼠李糖脂与双鼠李糖脂相比具有更好的亲油特性和乳化活性。这使得单鼠李糖脂在提高疏水性有...
【技术保护点】
1.一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法，其特征在于该方法是以铜绿假单胞菌为出发菌株，以催化单鼠李糖脂合成双鼠李糖脂的鼠李糖脂合成酶Ⅱ（RhlC）的编码基因
【技术特征摘要】
1.一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法，其特征在于该方法是以铜绿假单胞菌为出发菌株，以催化单鼠李糖脂合成双鼠李糖脂的鼠李糖脂合成酶Ⅱ（RhlC）的编码基因rhlC为改造目标，且按如下步骤进行：
1）根据铜绿假单胞菌的rhlC基因序列设计PCR引物；所设计的铜绿假单胞菌的rhlC基因的PCR引物为C-f：5'-CCGAAGCTTATGAGCGGCCTGTTCCACT-3'，C-r:5'-CTTGGAATTCCCGGAAGCTACGGACG-3'，上下游引物中分别引入在rhlC基因序列中没有、且在pK18mobSacB的多克隆位点（MCS）中含有的酶切位点（引物中划线部分），HindⅢ和EcoRⅠ；
2）以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，PCR扩增rhlC基因，克隆到pMD系列载体中，构建重组质粒pMD-rhlC；
3）根据rhlC基因序列内部特有的酶切位点，酶切rhlC基因序列内部，纯化自连，构建rhlC基因内部序列缺失的新质粒pMD-∆rhlC；
4）通过双酶切方法将∆rhlC片段插入到质粒pK18mobSacB中构建打靶质粒pK18-∆rhlC；
5）打把质粒pK18-∆rhlC导入到铜绿假单胞菌内，在筛选压力作用下，质粒pK18-∆rhlC与铜绿假单胞菌染色体基因发生二次同源重组，获得敲除rhlC基因的铜绿假单胞菌敲除菌株；
6）铜绿假单胞菌敲除菌株发酵生产验证，利用HPLC-MS方法验证单鼠李糖脂产物，利用排油圈法测定单鼠李糖脂产量。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤2）：PCR扩增rhlC基因的反应体系：10×PCRBuffer2.5μL，2.5mM的dNTPMixture2μL，10Μm的C-f和C-r引物各0.8μL，ExtaqPolymerase0.125μL，铜绿假单胞菌基因组DNA1μL，补充PCR水至总体系25μL；反应条件：95℃预变性3min，35个循环：94℃变性1min、56℃退火30s、72℃延伸1min30s，72℃10min；PCR产物经1.2%琼脂糖电泳、试剂盒切胶纯化后，rhlC基因片段与pMD系列（18/19/20）Tsimple载体进行AT连接，构建重组质粒pMD-rhlC。
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