一种高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高光学纯L‑乳酸工程菌的构建方法，包括多个步骤，本发明专利技术选取拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei NCBIO01)作为出发菌株，参照其全基因组序列，基于CRISPR/Cas9基因编辑方法构建了pNcasA‑△ldhD敲除质粒，无痕敲除D‑乳酸脱氢酶(ldhD)的同时过表达一个L‑乳酸脱氢酶基因(ldhL)，得到一株高光学纯L‑乳酸工程菌，使其L‑乳酸光学纯度从原来的95.6％提高到99％以上，并且生产速率达到5.5g/L/h以上，成为潜在的工业L‑乳酸高效生产菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法
本专利技术涉及乳酸菌
，具体涉及一株高光学纯L-乳酸工程菌及其构建方法。
技术介绍
乳酸作为一种多用途的天然有机酸，广泛应用于食品、日用化工、制药、纺织、环保和农业等诸多领域。乳酸的生产方法主要有微生物发酵法和化学合成法，微生物发酵生产乳酸具有成本低、光学纯度高、操作容易、安全性高以及污染小等优点，因此受到科研人员广泛关注。近年来，人们通过L-乳酸聚合生成聚L-乳酸(polylacticacid，PLA)，由于其生物相容性、可降解性以及无毒害作用等优良性能，能实现在生物圈中循环，是一种非常理想的高分子材料，在工业上具有广阔的应用前景。但是聚L乳酸的合成需要高光学纯度的L-乳酸作为前体物质，大多数同型乳酸发酵乳酸生产菌株具有较高的乳酸生产能力，但是会伴随着D-乳酸的生成，L-乳酸的光学纯度达不到合成聚乳酸的级别，必须通过下游的分离纯化步骤，加大了生产成本。目前大部分乳酸生产菌株都是通过自然筛选和人工诱变获得，然而这些乳酸生产菌株在发酵过程中都存在一些限制性因素，例如同时存在L-乳酸脱氢酶和D-乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法，其特征在于：所述构件方法包括：/n步骤1：制备PCR体系50μl，取PCR扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定成功后对PCR产物进行纯化回收；/n步骤2：根据拟干酪乳杆菌ldhD基因序列，在ldhD基因CDS区上游设计sgRNA,通过引物ldhDsg-F/ldhDsg-R PCR扩增得到sgRNA片段，以拟干酪乳杆菌基因组为模板，用引物ldhDup-F/ldhDup-R、ldhDdown-F/ldhDdown-R分别PCR扩增出ldhD上游同源臂和下游同源臂各1000bp，以ldhL-F/ldhL-R引物PCR扩增出L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)...

【技术特征摘要】
20200601 CN 20201048679611.一种高光学纯L-乳酸工程菌的构建方法，其特征在于：所述构件方法包括：
步骤1：制备PCR体系50μl，取PCR扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定成功后对PCR产物进行纯化回收；
步骤2：根据拟干酪乳杆菌ldhD基因序列，在ldhD基因CDS区上游设计sgRNA,通过引物ldhDsg-F/ldhDsg-RPCR扩增得到sgRNA片段，以拟干酪乳杆菌基因组为模板，用引物ldhDup-F/ldhDup-R、ldhDdown-F/ldhDdown-R分别PCR扩增出ldhD上游同源臂和下游同源臂各1000bp，以ldhL-F/ldhL-R引物PCR扩增出L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)，以pan7-1质粒为模板，以Amp-F/Amp-R引物PCR扩增出氨苄青霉素抗性基因片段；
步骤3：再用PCR将氨苄青霉素抗性基因片段、上游同源臂、ldhL基因、下游同源臂以及sgRNA融合，引物设计时需要使融合的片段之间存在20-40bp的重复区，五个片段融合的摩尔比为1:3:5:3:1，得到构建完成的质粒pNcas-△ldhD；
步骤4：将保存好的Lactobacillusparacasei甘油管在一级MRS茄子瓶涂布活化，37℃培养36h，然后将一级MRS茄子瓶菌体转接到二级茄子瓶中，37℃静止培养18h，将二级茄子瓶中的菌体用50mL的无菌水洗涤，在MRS平板中划线，37℃静置培养36h，挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃，110r/min过夜培养，按照5％的比例转接至50mL含有1％浓度甘氨酸的MRS液体培养基中，37℃,110r/min培养至OD620值为0.6，然后4500rpm，4℃离心10min收集菌体，电转缓冲液洗两遍，用1mL预冷的电转缓冲液重悬菌体，按每管80μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：田锡炜，张一凡，杭海峰，王永红，储炬，夏建业，庄英萍，
申请(专利权)人：华东理工大学，华东理工大学青岛创新研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31