一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用。高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌为丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的丙丁梭菌菌株。具体地，重组丙丁梭菌为Clostridium acetobutylicum TXYL，其于2020年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2020107。本发明专利技术提供的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌应用于秸秆水解液发酵生产丁醇，发酵周期缩短至24h，葡萄糖与木糖消耗速率加快，木糖利用率提高，实现了秸秆葡萄糖与木糖碳源的高效转化，丁醇得率与生产强度显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用。
技术介绍
丁醇是重要的化工原料，可用作工业化学品合成前体及重要溶剂，在医药工业、塑料工业、有机工业、印染等方面具有广泛应用。丁醇也是一种公认的新型可再生能源，可有效替代化石燃料，具有与汽油相容性性好、安全系数高、能量密度高以及抗爆性好等性能优势，以发酵法生产的生物丁醇可作为化石燃料的绿色替代品，发展潜力巨大，可以为摆脱化石燃料铺平道路。木质纤维素原料是世界上最为丰富的生物质资源，全球每年木质纤维素产量约为100亿吨，我国高达7.5亿吨，就地焚烧将造成严重的环境污染问题，而利用这些秸秆原料生产生物丁醇被认为是替代现有汽油和柴油等石油基燃料的经济型能源发展策略，将凸显可观的社会与环境效益。事实上，秸秆生物质主要由木质素、纤维素和半纤维素组成，通过必要预处理及纤维素酶水解释放多种可发酵碳源，秸秆生物质碳源主要包括木糖和葡萄糖。丙酮丁醇梭状芽胞杆菌(简称丙丁梭菌，Clostridiumacetobutylicum)广泛应用于丁醇发酵，为严格厌氧革兰氏阳性细菌，底物利用广泛，能够利用包括葡萄糖与木糖等在内的多种碳源。然而在葡萄糖存在的条件下，丙丁梭菌会优先消耗葡萄糖后，再继续利用木糖，不具备天然同步利用葡萄糖与木糖能力。另一方面，木糖被转运至丙丁梭菌胞内后，首先通过两步(木糖异构酶和木酮糖激酶)或三步(木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶)催化反应生成5-磷酸-木酮糖，进入磷酸戊糖途径(PentosePhosphatePathway，PPP)，涉及转醛酶、转酮酶、5-磷酸-核糖异构酶以及5-磷酸-核酮糖差向异构酶等关键酶，先后形成核糖-5磷酸、核酮糖-5磷酸、景天庚酮糖-7磷酸、赤藓糖-4磷酸、果糖-6磷酸、3-磷酸甘油醛等多种中间代谢产物，伴随ATP消耗，再进入后续丁醇合成途径。综上，丙丁梭菌木糖代谢途径冗长低效，木糖转化丁醇得率与效率严重受限。近年来，针对丙丁梭菌木糖转运转化途径开展了大量研究工作，例如，Xiao等[1]敲除了丙丁梭菌中葡萄糖依赖型磷酸转移酶系统编码基因g1cG，重组丙丁梭菌可以同步利用葡萄糖与木糖，随后与木糖代谢关键基因xylT，xylA及xylB协同过表达，发酵生产丁醇产量进一步提高；Ren等[2]敲除了丙丁梭菌中多效调控因子ccpA，重组丙丁梭菌能够同步利用葡萄糖与木糖发酵生产丁醇；Gu等[3]在丙丁梭菌中异源表达大肠杆菌转醛醇酶基因talA，木糖消耗与丁醇产量具有所提高；Gu等[4]在丙丁梭菌中协同过表达木糖代谢关键酶基因xylA、xylB、tal以及tkl；Jin等[5]在丙丁梭菌中协同过表达木糖代谢关键基因tal，tkt，rpe及rpi，所构建的重组丙丁梭菌木糖消耗与丁醇产量均有效提高。尽管这些研究工作一定程度提高了丙丁梭菌转运转化木糖能力，但局限于利用含有葡萄糖与木糖的合成培养基，且发酵周期大多长达60～120小时(h)，丁醇得率为0.1～0.2g/g，丁醇生产强度为0.1～0.2g/L/h，葡萄糖与木糖转化效率依然存在不足。因此，亟需一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用。在丙丁梭菌内过表达木糖转运蛋白编码基因xylT、新月柄杆菌木糖脱氢酶编码基因xylB与木糖内酯酶编码基因xylC，其中过表达xylT增强转运木糖能力；过表达xylB与xylC引入木糖酸合成途径，木糖经木糖脱氢酶和木酮糖内酯酶2步转化为木糖酸，提高木糖转化效率，同时不额外消耗ATP，且每利用1分子木糖生成1分子木糖酸过程中将额外生成1分子NADH，可促进丁醇合成代谢，提高丁醇得率与生产强度。事实上，假单胞菌属、醋杆菌属、气杆菌属、葡萄杆菌属、欧文氏菌属等好氧微生物能够天然合成木糖酸，大肠杆菌及酵母等好氧微生物经过基因工程改造，能够促进重组菌株利用木糖并合成木糖酸，本专利技术在严格厌氧微生物丙丁梭菌中，首次异源表达木糖酸合成途径，以解决现有技术中丙丁梭菌利用木质纤维素生物质碳源葡萄糖与木糖过程中，木糖转运转化效率低，发酵周期长，丁醇得率与生产强度低的技术问题。本专利技术的技术方案为：一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其为丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的丙丁梭菌菌株。在一个具体的实施方案中，通过构建丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的表达载体，并将所述表达载体导入到野生型出发菌株丙丁梭菌Clostridiumacetobutylicum以获得所述的重组丙丁梭菌。在一个具体的实施方案中，所述的表达载体为原核表达载体。在一个具体的实施方案中，所述的原核表达载体为载体质粒pIMP1。在一个具体的实施方案中，木糖内酯酶核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；新月柄杆菌木糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；丙丁梭菌木糖转运蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。进一步地，所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌为ClostridiumacetobutylicumTXYL，其于2020年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，菌种保藏编号为CCTCCNO：M2020107。另一方面，本专利技术提供了上述高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌的构建方法，具体包括以下步骤：1)通过酶切连接方法，将如SEQIDNO:3所示的丙丁梭菌木糖转运蛋白的核苷酸序列、如SEQIDNO:2所示的新月柄杆菌木糖脱氢酶的核苷酸序列和如SEQIDNO:1所示的木糖内酯酶核苷酸序列连接入载体质粒pIMP1中，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的5’端均连接有如SEQIDNO:4所示的丙丁梭菌启动子，获得重组质粒pIMP1-XylTBC。2)将步骤1)中获得的重组质粒pIMP1-XylTBC转入E.coliDH10B中，得到甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC。3)将步骤2)中经甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC转化至野生型出发菌株丙丁梭菌(Clostridiumacetobutylicum)，经培养、筛选获得丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的重组丙丁梭菌。另一方面，本专利技术提供了一种厌氧发酵生产丁醇的方法，其基于上述的重组丙丁梭菌或上述的重组丙丁梭菌的构建方法制备的重组丙丁梭菌，包括以下步骤：1)重组丙丁梭菌活化培养：将重组丙丁梭菌接种至液体活化培养基中，置于厌氧环境中静置培养，培养温度为37℃，静置活化培养16～24h用于种子培养；2)重组丙丁梭菌种子培养：将步骤1)中活化的菌种按10％(v/v)接种量接种于液体种子培养基中，置于厌氧环境中摇瓶培养，培养温度为37℃，转速为130～200rpm，培养18～24h用于发酵培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其特征在于，所述的重组丙丁梭菌为丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的丙丁梭菌菌株。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其特征在于，所述的重组丙丁梭菌为丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的丙丁梭菌菌株。


2.根据权利要求1所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其特征在于，通过构建丙丁梭菌木糖转运蛋白、新月柄杆菌木糖脱氢酶与木糖内酯酶协同过表达的表达载体，并将所述表达载体导入到野生型出发菌株丙丁梭菌(Clostridiumacetobutylicum)以获得所述的重组丙丁梭菌。


3.根据权利要求2所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其特征在于，所述的木糖内酯酶核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述的新月柄杆菌木糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述的丙丁梭菌木糖转运蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌，其特征在于，所述的高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌为ClostridiumacetobutylicumTXYL，于2020年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCCNO：M2020107。


5.一种如权利要求1-4中任一项所述的高效转化秸秆生物质碳源的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过酶切连接方法，将如SEQIDNO:3所示的丙丁梭菌木糖转运蛋白的核苷酸序列、如SEQIDNO:2所示的新月柄杆菌木糖脱氢酶的核苷酸序列和如SEQIDNO:1所示的木糖内酯酶核苷酸序列连接入载体质粒pIMP1中，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的5’端均连接有如SEQIDNO:4所示的丙丁梭菌启动子，获得重组质粒pIMP1-XylTBC；
2)将步骤1)中获得的重组质粒pIMP1-XylTBC转入E.coliDH10B中，得到甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC；
3)将步骤2)中经甲基化的重组质粒pIMP1-XylTBC转化至野生型出发菌株丙丁梭菌(Cl...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴又多，王振中，薛闯，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21