本发明专利技术公开了一种提高乳酰‑N‑三糖II产量的基因工程菌及生产方法，属于微生物基因工程领域。本发明专利技术通过组合调控乳酰‑N‑三糖II合成途径中glmM，glmU，glmS以及lgtA的表达，从而精确调控代谢通路的碳通量，缓解代谢压力，敲除大肠杆菌宿主乳酰‑N‑三糖II合成途径中wecB，nagB和lacZ的表达，进一步提高乳酰‑N‑三糖II的产量，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰‑N‑三糖II的能力由0.53g/L提升至4.82g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑三糖II的产量达到46.2g/L，具备工业应用的前景。
【技术实现步骤摘要】
一种提高乳酰-N-三糖II产量的基因工程菌及生产方法
本专利技术涉及一种提高乳酰-N-三糖II产量的基因工程菌及生产方法，属于微生物基因工程领域。
技术介绍
母乳通常被认为是提供婴儿营养的最重要的来源。作为母乳中含量第三的固体组分，对于婴幼儿有益肠道菌群的生长以及预防病原菌与上皮细胞的粘附，母乳寡糖的合成发挥着重要的作用。已经报道的母乳寡糖的种类有两百多种，主要分为三大类，唾液酸化，岩藻糖基化和非岩藻糖基化的中性母乳寡糖，并分别占比12％-14％，35％-50％和42-55％。其中占比最高的非岩藻糖基化的中性母乳寡糖，主要包括乳酰-N-四糖(LNT)和乳酰-N-新四糖(LNnT)。大量文献集中报道这两种中性四糖对婴幼儿的健康具有明显的促进作用，因此受到广泛关注，具备应用于婴幼儿产品的广泛前景。其中乳酰-N-新四糖已经允许添加进商品化婴幼儿配方奶粉中。但是目前四糖和新四糖的生产成本较高且生产方法有一定局限性。乳酰-N-三糖II(LNTII)，作为母乳寡糖普遍的核心骨架之一，也是乳酰-N-四糖和乳酰-N-新四糖的直接前体物质，在合成两种四糖以及其他复杂母乳寡糖上具有重要意义。因此乳酰-N-三糖II的高效生产的方法急需开发，为生成更多有价值的母乳寡糖的合成奠定重要基础。目前研究乳酰-N-三糖II合成的主要为化学合成，酶法和微生物合成方法均较少。酶法合成是较早尝试合成乳酰-N-三糖II的方法，并已有数十年的报道。初期，人源β-1,3-N-乙酰葡萄氨转移酶(β-1,3-GnT)被用来催化合成乳酰-N-三糖II使用乳糖作为受体，UDP-乙酰葡糖胺作为供体。随后，使用粗牛血清β-1,3-GnT为催化剂，市售UDP-乙酰葡糖胺和乳糖为底物，乳酰-N-三糖II的产量达到mmol规模。二十年前，发现脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)的细菌β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶(LgtA)在合成含LNT的脂寡糖中发挥了作用。LgtA被广泛用在体内乳酰-N-三糖II的合成，一般利用内源性的UDP-乙酰葡糖胺和外源供给的乳糖分别作为供体和受体。最开始，Samain团队使用β-半乳糖苷酶阴性(lacZ-)大肠杆菌JM109菌株作为宿主，并增强了乳糖通透酶(LacY)的表达以在细胞内积累乳糖。外源引入脑膜炎奈瑟氏球菌LgtA以产生乳酰-N-三糖II，分批补料发酵的滴度为6g/L(Priem等，2002)。Albermann团队通过染色体整合构建了携带脑膜炎双球菌gtA基因的无质粒lacZ-lacY+大肠杆菌菌株，以产生乳酰-N-三糖II，在培养瓶中的滴度为2.465g/L(等人，2014和2015)。最近，通过对两个关键基因lgtA和lgtB(编码β-1,4-半乳糖基转移酶)进行染色体整合，改造了枯草芽孢杆菌以产生乳酰-N-新四糖(LNnT)，经过优化步骤后，工程菌株同时生产了乳酰-N-新四糖(LNnT)和乳酰-N-三糖II，在分批分批培养中的滴度分别为4.52-5.41和2.64-2.98g/L(Dong等人，2019年和2020年)。相比于酶法合成，以微生物发酵法合成乳酰-N-三糖II更加高效和安全。但目前使用的微生物方法合成的乳酰-N-三糖II产量均较低，并不能达到工业化大规模生产的要求，因此，为了解决目前微生物生产的瓶颈，打造更高效的生产菌株是非常必要的。
技术实现思路
针对现有的技术难点及存在的问题，本专利技术提供了一种高效生产乳酰-N-三糖II的大肠杆菌工程菌及其构建方法。本专利技术的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌为(a)或(b)或(c)：(a)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB的表达，并过表达葡萄糖胺合成酶(GlmM)、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(GlmU)和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶；(b)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶NagB，并过表达葡萄糖胺合成酶(GlmM)、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(GlmU)和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶；(c)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶NagB和β-半乳糖苷酶LacZ的表达，并过表达葡萄糖胺合成酶(GlmM)、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(GlmU)和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶WecB的NCBI序列号为YP_026253.1，葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶NagB的NCBI序列号为NP_415204.1，β-半乳糖苷酶LacZ的NCBI序列号为NP_414878.1。在本专利技术的一种实施方式中，葡萄糖胺合成酶(GlmM)的编码基因为glmM，UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(GlmU)的编码基因为glmU，葡萄糖胺-6-磷酸合成酶(GlmS)的编码基因为glmS。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌含有载体pRSFDuet-1和/或pETDuet-1，所述载体上含有葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和/或β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的编码基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌含有强调控的RBS，所述RBS用于调控目的基因的过表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pRSFDuet-1表达glmM和glmU-glmS基因，以pETDuet-1表达lgtA基因。在本专利技术的一种实施方式中，将载体pRSFDuet-1上的核糖体结合位点替换为RBS29。在本专利技术的一种实施方式中，核糖体结合位点RBS29，RBST7和RBS31的核苷酸序列依次为SEQIDNO.5～7。在本专利技术的一种实施方式中，所述glmM、glmU和glmS来源于大肠杆菌K-12(Escherichiacolik-12)，核苷酸序列分别如SEQIDNO.1～3所示。在本专利技术的一种实施方式中，β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的编码基因为lgtA。在本专利技术的一种实施方式中，所述lgtA来源于脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)，核苷酸序列为SEQIDNO.4。本专利技术提供了一种构建所述重组大肠杆菌的方法，先在大肠杆菌基因组中敲除UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶、和/或β-半乳糖苷酶的编码基因，再利用表达载体，过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的编码基因。在本专利技术的一种实施方式中，利用pTargetF质粒敲除目的基因。在本专利技术的一种实施方式中，将pTargetF质粒上的N20替换为与目的基因互补的N20序列。在本专利技术的一种实施方式中，表达载体为pRSFDuet-1和/或pETDuet-1，所述重组大肠杆菌以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，为(a)或(b)或(c)：/n(a)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的表达，并过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶；/n(b)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶，并过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶；/n(c)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶和β-半乳糖苷酶的表达，并过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶。/n
【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，为(a)或(b)或(c)：
(a)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的表达，并过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶；
(b)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶，并过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶；
(c)沉默UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶、葡萄糖胺-6磷酸脱氨酶和β-半乳糖苷酶的表达，并过表达葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶和β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述葡萄糖胺合成酶、UDP-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶和葡萄糖胺-6-磷酸合成酶的编码基因来源于大肠杆菌K-12。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，β-1,3-乙酰葡萄糖胺转移酶的编码基因来源于脑膜炎奈瑟球菌。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，含有载体pRSFDuet-1和/或pETDuet...
【专利技术属性】
技术研发人员：沐万孟，张文立，朱莺莺，万李，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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