一种氧胁迫诱变筛选利福霉素SV高产菌株的方法技术

一种氧胁迫诱变筛选利福霉素SV高产菌株的方法，是基于氧限制模型和低温等离子体诱变处理相结合获得利福霉素SV低氧耐受的高产菌株的高效育种方法，包括：在利福霉素SV的生产菌株地中海诺卡氏放线菌选育过程中，利用氧限制模型平板筛选低氧情况下能够快速生长、菌苔颜色深褐色的菌株；在筛选培养基中添加0.8～1.2g/L的无水亚硫酸钠制备筛选平皿，将低温等离子体诱变处理时间为22～28秒的菌悬液稀释涂布在氧限制平皿培养基上，28℃培养6～7天，挑选生长较快、颜色较深菌株，能够显著提升筛选的正突变率。本发明专利技术能筛选到低氧条件下能够快速生长和进行产物合成的高效利福霉素生产菌株，很好地适应生产过程的氧限制环境，并表现出良好的发酵生产能力。

【技术实现步骤摘要】
一种氧胁迫诱变筛选利福霉素SV高产菌株的方法
本专利技术涉及一种筛选利福霉素SV高产菌株的方法，特别是一种氧胁迫诱变筛选利福霉素SV高产菌株的方法。
技术介绍
利福霉素SV类抗生素由地中海链丝菌产生的一类抗生素，它具有广谱抗菌作用，对结核杆菌、麻风杆菌、链球菌、肺炎球菌等革兰氏阳性细菌，特别是耐药性金黄色葡萄球菌的作用都很强。对某些革兰氏阴性菌也有效。利福霉素SV类药物有：利福霉素SVB二乙酰胺、利福平等。目前在临床应用的有利福平、利福喷汀及利福布汀。利福霉素SV的结构式如下：在现行的利福霉素SV批培养发酵工艺中，大多仅仅采pH、DO、温度等作为控制策略的依据和手段。这些参数大多数情况仅仅能反应出设备的性能或者操作条件，而不能实时的、真实的反应出微生物的生理状态。福霉素发酵过程属于耗氧发酵，供氧对生产菌株的生长和产物形成有着重要的影响。在利福霉素发酵过程中，必须提供合适的搅拌和通气，菌体才能繁殖和积累所需代谢产物。此外，在不同发酵阶段的菌体的需氧量是不同的，发酵液的供氧能力的大小直接影响微生物的酶的活性、代谢途径及产物产量。因此研究供氧大小对发酵的影响及控制对提高生产效率，改善产品质量等都有重要意义。一般的耗氧发酵过程均控制较高的供氧以避免氧限制的发生，在这种情况下可以以溶解氧浓度(DissolvedOxygen,简称DO)来表征供氧水平，通过控制搅拌转速和空气流量可以有效的控制DO。由于利福霉素属于次级代谢产物，发酵周期较长，因此培养基中往往会加入大量的豆饼粉、花生饼粉、玉米粉等原料，这些原料溶解和灭菌处理后，发酵液的粘度较高，限制了氧的传递。同时利福霉素发酵前期，随着菌体浓度的增长，发酵液粘度急剧上升。发酵中前期的氧供应对于菌体生长和启动利福霉素SV合成非常关键。为了保证充足的氧供应，需要提升搅拌转速和空气流量来维持一定的供氧水平，造成了大量的动力消耗，同时，高的搅拌功率对菌体也有很大的损伤，影响菌体的生长和合成代谢。能够适应利福霉素大型生产发酵罐中供氧能力限制的生产菌株的获得一直是本行业生产菌筛选的关键，然而相应育种方面的研究较少，仅有的一些研究主要采用常规的诱变育种技术，进行突变株的筛选，很难筛选到能够耐受氧限制环境的高产菌株。也有从发酵培养后期的发酵液中分离相应的耐受低氧的菌株，但分离到的菌株很难具备低氧环境的高效表达特性，也难于实现性状的稳定遗传。专利技术人检索到以下相关专利文献：CN105505915A公开了一种使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株方法，采用新型常压室温等离子体射流诱变系统构建降解甲醛菌株的诱变育种体系，结合高浓度甲醛梯度双层琼脂培养基筛选手段，获得一系列高活性耐受甲醛降解效率发生变化的突变株。CN109797116A公开了一种通过叠加式ARTP诱变筛选强抑菌活性的海绵共附生链霉菌HNS054突变株，将链霉菌(Streptomycessp.)HNS054与金黄色葡萄球菌分别进行振荡培养；制备野生链霉菌单孢子悬液；对野生型链霉菌孢子进行ARTP诱变；ARTP诱变致死率和阳性率的计算；诱变菌株的筛选；抑菌活性的测定。通过3轮叠加式ARTP诱变对菌株进行诱变处理，并与抑菌活性筛选相结合，增强了诱变强度，使得基因突变范围更广，突变效率更快。优化后的诱变时间为120s，致死率为99％左右时，更容易获得活性突变菌株。采用多次诱变的方法，最终获得了3株抑菌直径增加了27％左右且遗传性能稳定的突变株。以上这些技术对于如何提供一种氧胁迫诱变筛选利福霉素SV高产菌株的方法，该方法能筛选到低氧条件下能够快速生长和进行产物合成的高效利福霉素生产菌株，能够很好地适应生产过程的氧限制环境，并表现出良好的发酵生产能力，并未给出具体的指导方案。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种氧胁迫诱变筛选利福霉素SV高产菌株的方法，该方法能筛选到低氧条件下能够快速生长和进行产物合成的高效利福霉素生产菌株，高产菌株的遗传稳定性好，能够很好地适应生产过程的氧限制环境，并表现出良好的发酵生产能力。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种氧胁迫诱变筛选利福霉素SV高产菌株的方法，所述方法是基于氧限制模型和低温等离子体ARTP诱变处理相结合获得利福霉素SV低氧耐受的高产菌株的高效育种方法，其技术方案在于所述方法包括如下工艺步骤：在利福霉素SV的生产菌株地中海诺卡氏放线菌选育过程中，利用氧限制模型平板筛选低氧情况下能够快速生长、菌苔颜色深褐色的菌株；在筛选培养基中添加0.8～1.2g/L的无水亚硫酸钠制备筛选平皿，即氧限制平皿培养基中控制无水亚硫酸钠浓度在0.8～1.2g/L，将低温等离子体ARTP诱变处理时间为22～28秒的菌悬液稀释涂布在氧限制平皿培养基上，28℃培养6～7天，挑选生长较快、颜色较深菌株，能够显著提升筛选的正突变率(21.3±2.0％)。所述的耐受氧限制的高产菌株在低氧供应水平下利福霉素SV的产物合成量≥7900mg/mL。上述技术方案中，优选的技术方案可以是，所述的氧限制模型中无水亚硫酸铵的添加量最好为1.0g/L。低温等离子体ARTP诱变处理时间最好为25秒。综上所述，本专利技术的方法是一种基于氧限制模型和低温等离子体ARTP诱变处理相结合获得利福霉素SV低氧耐受的高产菌株的高效育种方法，在筛选培养基中添加无水亚硫酸钠制备筛选平皿，将ARTP诱变处理的菌悬液稀释涂布在氧限制平皿培养基上，高模型能够显著提升筛选菌株的正突变率，并实现在设备氧限制条件下大幅度提升发酵水平。本专利技术针对上述已有技术中的难题，本专利技术将微生物菌种诱变处理技术与氧限制模型相结合，筛选到低氧条件下能够快速生长和进行产物合成的高效利福霉素生产菌株，高产菌株的遗传稳定性好，能够很好地适应生产过程的氧限制环境，并表现出较好的发酵生产能力。本专利技术通过定向氧限制模型，筛选能够耐受低氧环境的利福霉素高产菌株，结果表明筛选到的耐受低氧的突变菌株能快速提升利福霉素SV的发酵效率。以下为实验部分：1.材料和方法1.1菌种和培养基菌种：地中海诺卡氏放线菌(即地中海诺卡氏菌)，可以由河北欣港药业有限公司提供(公司内部编号：地中海诺卡氏放线菌NSMXG-B23)。种子培养基(g/L)：葡萄糖40g，蛋白胨20g，鱼粉4.6g，硝酸钾5.8g，碳酸钙2.6g，泡敌1mL，其中葡萄糖单独灭菌后加入培养基中。发酵培养基(g/L)：葡萄糖55g，蛋白胨10g，豆饼粉34g，鱼粉6.6g，硝酸钾10.6g，碳酸钙5.3g，泡敌1mL，其中葡萄糖单独灭菌后加入培养基中。1.2仪器和试剂仪器：常压室温等离子体诱变仪ARTP-IIS型(北京思清源生物技术公司)：ARTP诱变；5L反应器(上海国强生化工程装备有限公司)：发酵培养；高效液相色谱(美国AgilentTechnologiesInc.Agilent1100series)：尾气质谱仪(上海舜宇恒平仪器有限公司):气体中O2、CO2检测；发酵罐：上海国强生化装备有限责本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氧胁迫诱变筛选利福霉素SV高产菌株的方法，所述方法是基于氧限制模型和低温等离子体ARTP诱变处理相结合获得利福霉素SV低氧耐受的高产菌株的高效育种方法，其特征在于所述方法包括如下工艺步骤：/n在利福霉素SV的生产菌株地中海诺卡氏放线菌选育过程中，利用氧限制模型平板筛选低氧情况下能够快速生长、菌苔颜色深褐色的菌株；/n在筛选培养基中添加0.8～1.2g/L的无水亚硫酸钠制备筛选平皿，即氧限制平皿培养基中控制无水亚硫酸钠浓度在0.8～1.2g/L，将低温等离子体ARTP诱变处理时间为22～28秒的菌悬液稀释涂布在氧限制平皿培养基上，28℃培养6～7天，挑选生长较快、颜色较深菌株，能够显著提升筛选的正突变率。/n

【技术特征摘要】
1.一种氧胁迫诱变筛选利福霉素SV高产菌株的方法，所述方法是基于氧限制模型和低温等离子体ARTP诱变处理相结合获得利福霉素SV低氧耐受的高产菌株的高效育种方法，其特征在于所述方法包括如下工艺步骤：
在利福霉素SV的生产菌株地中海诺卡氏放线菌选育过程中，利用氧限制模型平板筛选低氧情况下能够快速生长、菌苔颜色深褐色的菌株；
在筛选培养基中添加0.8～1.2g/L的无水亚硫酸钠制备筛选平皿，即氧限制平皿培养基中控制无水亚硫酸钠浓度在0.8～1.2g...

【专利技术属性】
技术研发人员：史守坤，栗波，李海东，贾军巧，王泽建，王萍，刘爱军，
申请(专利权)人：河北欣港药业有限公司，通辽凯源生物有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13