用于监测环境污染物的发光菌的复壮方法技术

本发明专利技术属于生物环境监测技术领域，公开了用于监测环境污染物的发光菌的复壮培养液及其复壮方法，其包括如下组份：氯化钠，氯化镁，三磷酸腺苷，蛋氨酸，醋酸钙，无菌脱纤维绵羊血。本发明专利技术通过对复壮培养液进行优化和改进，20‑30min之内快速激活了静息细胞，菌体细胞存活率和酶活力较现有技术明显提高，发光效率完全恢复，有助于快速准确地监测环境污染物。

【技术实现步骤摘要】
用于监测环境污染物的发光菌的复壮方法
本专利技术属于生物环境监测
，涉及用于监测环境污染物的发光菌的复壮方法，尤其涉及用于监测环境污染物的鳆发光杆菌的复壮方法。
技术介绍
环境监测方法可以划分为两类:理化分析技术和生物监测。其中理化分析技术常常用于单一理化指标的测试，但不能反应污染物毒性的大小。传统的生物监测以水蚤、藻类或鱼类等为受试对象，虽然能反映毒物对生物的直接影响，但是这些方法的最大缺点是实验周期长，实验比较繁琐。近年来，针对传统生物毒性检测方法的不足，发光细菌法作为一种新型生物毒性监测技术正在广泛应用，引起了广大环保科研工作者的关注。发光细菌用于环境毒性检测过程中，菌种是重要的影响因素。发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌,这种可见荧光波长在450-490nm之间，在黑暗处肉眼可见。发光细菌是一种分布很广泛的发光生物，目前已知的发光细菌分为四属，分别是弧菌属、发光杆菌属、希瓦氏菌属和光杆菌属。按照生存环境来分类，发光细菌可以分为海洋发光细菌、淡水发光细菌和陆地发光细菌。海洋发光细菌根据其DNA相似程度可分为五簇，哈维氏弧菌、费氏弧菌、发光杆菌、羽田西瓦氏菌和创伤弧菌。已知的淡水发光细菌有感染甲壳类生物的霍乱弧菌和青海弧菌。陆地上的发光细菌寄生在昆虫或者动物体内，主要是光杆菌属，包括发光光杆菌、温和光杆菌、非共生光杆菌。发光菌在使用过程中，一般是以冻干粉的形式存在，使用时进行复苏或扩大培养，而该过程决定着菌株的数量和活力，复苏工艺不当会造成菌株大量死亡从而造成亮度不够难以进行毒性测试，而且复苏培养液中的组分可能会对菌株发光会造成一定的影响。然而，不同的发光菌由于分类学和理化性质的不同，复苏以及培养工艺也存在较大的差异。现有技术对发光菌的复苏和培养有一些记载。文献1：CN102465097A，通过开发专门的细菌冻存培养基和复苏溶液，实现发光细菌菌种的长期保存和快速复苏，既节省了测试成本，也大大缩短了毒性测试的时间，为化学污染物的快速毒性试测试提供了可能。冻存培养基的组成，包括无机组分(如氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钾等)，有机组分(包括胰蛋白胨、酵母浸膏、氨基酸、甘油、维生素、葡萄糖等)。复苏溶液的组成，包括无机组分(如氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾等)和有机组分(包括胰蛋白胨、酵母浸膏、氨基酸、甘油、维生素、葡萄糖等)。但是上述冻干培养基和复苏溶液并没有具体组分的配比关系。文献2：CN102604873A公开了一种海洋发光细菌的复壮方法，复壮培养基含有酪蛋白水解酶2-8g/L，甘油磷酸钠20-25g/L，酵母膏2.5g/L。文献3：CN109593692A公开了一种发光细菌的培养基，包括以下重量份原料；0.4-0.6份酵母浸出汁、0.4-0.6份胰蛋白陈、2-4份NaCl、0.4-0.6份Na2HPO4、0.05-0.15份KH2PO4、0.2-0.4份甘油和98-102份蒸馏水。文献4：CN110724639A公开了一种用于费氏弧菌冻干制剂，包含菌泥和冻干保护剂，冻干保护剂由以下原料组成：脱脂乳的含量为15wt%，蔗糖的含量为6wt%，壳聚糖的含量为0.6wt%，谷氨酸钠的含量为1wt%，四氢嘧啶的含量为0.4wt%，余量为蒸馏水。文献5：CN111206000A公开了发光细菌冻干粉试剂盒及其制备方法。该制备方法包括：将菌种冻干粉复苏，接种培养，得到发光细菌菌液，256倍稀释后检测其发光量；吸取一定量体积的发光细菌菌液进行冷冻离心，得到菌体；将菌体与保护剂混合，得到菌体混合液；将菌体混合液进行真空冷冻干燥，得到发光细菌冻干粉；所述保护剂由0.001～0.05g/mL精氨酸、浓度为pg/mL的脱脂奶粉、0.01～0.05g/mL氯化钠、0.05～0.3g/mL淀粉、0.05～0.3g/mLD-山梨醇、0.01～0.05g/mL维生素E和水组成。文献6：鲍鱼希瓦氏菌发酵条件的优化，上海海洋大学学报2017年，对鲍鱼希瓦氏菌培养基和培养条件进行优化，运用单因素实验和正交实验对发酵条件进行优化，并在70L发酵罐上进行扩大培养，最优培养基为蔗糖6%，蛋白胨2.5%，碳酸钙0.7%，初始pH6.8，最优摇瓶培养条件为温度30℃，转速130r/min，装液量100mL/500mL，接种量6%，收获时间24h，70L发酵罐生物量达到1.14×1011cfu/ml。上述复苏、扩大培养方式大多针对明亮发光杆菌、费氏弧菌以及希瓦氏菌，并不适合鳆发光杆菌。尽管为明亮发光杆菌和鳆发光杆菌同属异种，在菌体形态特征和生理生化特征上二者均存在较大差异。文献7：CN101685066A筛选出一株鳆发光杆菌YL，将单菌落接于150mL液体培养基中(培养基组成：蛋白胨5g、酵母膏1g、FePO40.1g、NaCl20g、甘油3ml、蒸馏水1000ml)，26℃，150r/m摇床培养6h左右，发光值达到2.0×105-4.0×105。但是该文献并没有公开鳆发光杆菌的复苏或扩大培养等步骤。文献8：CN101874105A公开了一种介质组合物，该组合物包括：1.0-3.0％的NaCl/KCl、0.5-7.0％的肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖、0.0-300mM的Mg/Ca、0.01-0.05％的酵母提取物/酸水解酪素、0.02-1.0％的牛血清白蛋白/卵白蛋白和0.1-3.5％的乙醇/甲醇/丙醇；将发光细菌悬液贮存在用于维持发光细菌存活并防止细菌扩张的条件下2周。该文献8在应用中的实际意义并不大，在实际操作中，一般需要对冻干粉进行复苏复壮，在复苏复壮过程中，快速恢复菌体发光活力，减少菌体死亡，使得发光菌能够在第一时间内应用于环境中污染物的监测。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的缺陷，申请人提出了用于监测环境污染物的鳆发光杆菌的复壮方法，该复壮方法能够将鳆发光杆菌冻干粉快速复苏复壮，菌体存活力达到90%以上，发光效率没有明显变化。本专利技术是通过如下技术方案来实现的。用于监测环境污染物的发光菌的复壮培养液，其特征在于，所述复壮培养液包括如下组份：氯化钠，氯化镁，三磷酸腺苷，蛋氨酸，醋酸钙，无菌脱纤维绵羊血。进一步地，所述复壮培养液包括如下组分：氯化钠10-30g/L，氯化镁4-7g/L，三磷酸腺苷3-5g/L，蛋氨酸1-2g/L，醋酸钙0.5-1g/L，无菌脱纤维绵羊血30-50ml/L。更进一步地，所述复壮培养液组分如下：氯化钠26g/L，氯化镁6g/L，三磷酸腺苷4g/L，蛋氨酸1g/L，醋酸钙0.8g/L，无菌脱纤维绵羊血35ml/L。更进一步地，所述复壮培养液组分如下：氯化钠18g/L，氯化镁5g/L，三磷酸腺苷3g/L，蛋氨酸1g/L，醋酸钙0.5g/L，无菌脱纤维绵羊血30ml/L。更进一步地，所述复壮培养液组分如下：...

【技术保护点】
1.用于监测环境污染物的发光菌的复壮培养液，其特征在于，所述复壮培养液包括如下组份：氯化钠，氯化镁，三磷酸腺苷，蛋氨酸，醋酸钙，无菌脱纤维绵羊血。/n

【技术特征摘要】
1.用于监测环境污染物的发光菌的复壮培养液，其特征在于，所述复壮培养液包括如下组份：氯化钠，氯化镁，三磷酸腺苷，蛋氨酸，醋酸钙，无菌脱纤维绵羊血。


2.根据权利要求1所述的复壮培养液，其特征在于，所述复壮培养液包括如下组分：
氯化钠10-30g/L，
氯化镁4-7g/L，
三磷酸腺苷3-5g/L，
蛋氨酸1-2g/L，
醋酸钙0.5-1g/L，
无菌脱纤维绵羊血30-50ml/L。


3.根据权利要求1或2所述的复壮培养液，其特征在于，所述复壮培养液组分如下：
氯化钠26g/L，
氯化镁6g/L，
三磷酸腺苷4g/L，
蛋氨酸1g/L，
醋酸钙0.8g/L，
无菌脱纤维绵羊血35ml/L。


4.根据权利要求1或2所述的复壮培养液，其特征在于，所述复壮培养液组分如下：
氯化钠18g/L，
氯化镁5g/L，
三磷酸腺苷3g/L，
蛋氨酸1g/L，
醋酸钙0.5g/L，
无菌脱纤维绵羊血30ml/L。


5.根据权利要求1或2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文霞，马云，
申请(专利权)人：山东省临沂生态环境监测中心，朱文霞，
类型：发明
国别省市：山东;37