一种添加儿茶素没食子酸酯提高变色栓菌漆酶产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种添加儿茶素没食子酸酯提高变色栓菌漆酶产量的方法，涉及生物工程技术领域。该方法包括：在变色栓菌漆酶发酵过程的菌丝体生长阶段，向发酵培养基中添加儿茶素没食子酸酯，并继续发酵以产生漆酶。应用该方法能够大幅提高变色栓菌的漆酶产量；并且该方法操作简单，易于放大生产，适于大规模漆酶发酵，从而降低漆酶生产成本，满足规模化应用的要求。

A method of increasing laccase production by adding catechin gallate

【技术实现步骤摘要】
一种添加儿茶素没食子酸酯提高变色栓菌漆酶产量的方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种提高变色栓菌漆酶产量的方法。
技术介绍
漆酶(二醇∶氧氧化还原酶，EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，能氧化多种不同结构的底物，同时将分子氧还原成水。漆酶首先在Toxicodendronvernicifluum(日本漆树，以前称为Rhusvernicifera)中被发现，而后通过大量的研究发现漆酶在自然界中分布于多种植物、真菌、少数细菌和昆虫中，其中真菌漆酶是漆酶的主要来源。目前漆酶主要用于有机合成、环境污染物的降解和染料脱色、生物检测和电化学分析、造纸工业中的纸浆漂泊和废水处理、纤维原料的降解等，正在不断地推进漆酶走向工业化应用的步伐。然而，目前漆酶在工业化应用中还存在发酵表达水平低、分离纯化操作复杂、实际应用成本高等问题，因此，提高漆酶发酵水平、降低应用成本成为漆酶相关研究中急需解决的问题。漆酶的生产主要采用两种发酵方式：液态发酵和固态发酵。液态发酵具有传质好、混合均匀、易放大的优势，采用这种方式进行漆酶生产在一定程度上降低了漆酶的生产成本。但液态发酵获得的漆酶的浓度较低，增加了漆酶分离纯化的难度。固态发酵是微生物在没有或基本游离水的质上方式，利用自然底物或利用惰性底做固体支持，更符合真菌的自然生长条件。与液态发酵相比，漆酶固态发酵具有水分活度低，微生物易生长，酶活力高，酶系丰富等优点。变色栓菌是用于漆酶生产的优良真菌菌株，其已经有商业化漆酶产品在售，用途广泛。真菌漆酶的合成可通过诱导剂来调控，达到增加漆酶产量的目的。目前已经报道的用于漆酶诱导表达的诱导剂主要包括：芳香族化合物，如愈创木酚、2,5-二甲基苯胺、藜芦醇、对羟基苯甲酸、阿魏酸、香草酸等；以Cu2+为代表的金属离子；氨基酸和维生素等。酚类、木质素或木质素衍生物等芳香族类化合物通常被添加到真菌培养基中提高漆酶产量，激发漆酶催化聚合反应从而发挥防御作用，减少氧自由基引起的氧化应激反应。添加1mM愈创木酚作用于不同的真菌可提高漆酶2倍以上漆酶产量，但当培养基中含有高浓度(>1mM)的外源性芳香族化合物时，由于无法适应生长环境，菌丝体的生理状态受抑制从而影响细菌生长。但是，芳香族化合物通常都具有毒性，使用其作为诱导剂可能会由于残留造成环境污染。金属对漆酶的转录调控广泛存在于真菌中，而漆酶作为一种含铜多氧酶，铜对漆酶的诱导中有重要作用，Ag+、Mg2+也被称为漆酶转录调节器。在400μM的Cu2+浓度下产量大幅提高，但过渡态重金属离子的添加同样可能会造成环境污染；额外添加氨基酸和维生素可在一定程度上增加漆酶产量，但效果有限，且生物素、核黄素等价格昂贵。由此可见，现有的漆酶诱导剂均存在各自的缺点和不足，探索天然无污染的高效诱导剂提高生产漆酶是研究的热点，而从自然界中寻找天然酚类诱导剂是解决此问题的有效途径之一。专利申请人通过对大量天然酚类物质漆酶诱导表达效果和机制的研究发现，儿茶素没食子酸酯(CG)是一种极具潜力的漆酶诱导物，具有诱导效率高、用量少、适用范围广的优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高变色栓菌漆酶产量的方法。该方法能够大幅提高变色栓菌的漆酶产量；并且该方法操作简单，易于放大生产，适于大规模漆酶发酵，从而降低漆酶生产成本，满足规模化应用的要求。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供以下技术方案：一种提高变色栓菌漆酶产量的方法，包括：在变色栓菌漆酶发酵过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加儿茶素没食子酸酯，并继续发酵以产生漆酶。优选地，所述儿茶素没食子酸酯添加的终浓度为1～10mg/L，进一步优选为2～5mg/L，更进一步优选为4～5mg/L。优选地，以儿茶素没食子酸酯溶液的形式向发酵培养基中添加，所述法没食子酸酯溶液的配制溶剂为水、甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇的一种或至少两种的混合，进一步优选为水或乙醇。所述混合典型但非限定性的实例有：水和甲醇的混合，水和乙醇的混合，水和正丙醇的混合，水和异丙醇的混合，甲醇和乙醇的混合，甲醇和异丙醇的混合，乙醇和正丙醇的混合，乙醇和异丙醇的混合，正丙醇和异丙醇的混合，乙醇、正丙醇和异丙醇的混合等。没食子酸酯易溶于有机溶剂，上述溶剂是配制没食子酸酯溶液的良好溶剂，并且对变色栓菌的菌丝体生长和漆酶合成无副作用。一种添加儿茶素没食子酸酯提高变色栓菌漆酶产量的方法，按照下述步骤进行(1)将预培养的变色栓菌菌丝体接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养；(2)在所述发酵培养过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加儿茶素没食子酸酯溶液；(3)在菌丝体对数生长期结束并进入漆酶主要合成阶段后，选择适于漆酶表达和分泌的发酵培养条件和发酵培养时间，并继续培养以产生漆酶；(4)培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集固态发酵基质。所述步骤(1)中所述变色栓菌菌丝体预培养物培养方法，按照下述步骤进行：斜面菌丝体的活化方法如下：采用常用土豆葡萄糖琼脂(PDA)培养基配置方法配制斜面菌丝体活化用培养基，其中土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L；将变色栓菌(CICC14001)菌丝(0.5cmx1cm)1块接种到该培养基试管斜面上，30℃培养7天。采用常用土豆葡萄糖培养基配制方法配制菌丝预培养用的培养基，其中土豆200g/L、葡萄糖20g/L；将活化后的斜面菌丝体(0.5cmx1cm)3块接种于100mL土豆葡萄糖培养基中，于25℃、150r/min条件下培养7天；将该培养物均质后按10％(v/v)接种量再次转接入新鲜的土豆葡萄糖培养基中，于25℃、150r/min条件下培养5天，即得预培养的菌丝体，用于漆酶固态发酵。所述步骤(1)中所述漆酶固态发酵培养基：麦麸和基础无机盐培养基按1:3(w/w)比例混合；其中基础无机盐培养基组成为Ca(NO3)2·4H2O0.5g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L，其余为水。所述步骤(1)中发酵培养的具体条件：发酵培养基起始pH为6.1～8.0，优选为6.5～7.5，更优选为6.5～7.0。所述步骤(1)中所述变色栓菌菌丝体接种后发酵基质中的初始生物量为0.02～0.15mg/g，优选为0.02～0.06mg/g，更优选为0.03～0.05mg/g；所述发酵培养过程中菌丝体生长温度为22～28℃，优选为24～28℃，更优选为25～27℃；所述发酵培养过程中菌丝体培养的时间为24～96h，优选为36～74h，更优选为44～40h。一般地，变色栓菌漆酶发酵过程中，从接种到完成菌丝体生长需要24～48h的时间。所述步骤(2)中向发酵液中添加儿茶素没食子酸酯溶液为一次性或分多次添加，分多次添加时，每次加入后搅拌均匀，优选一次性添加；所述儿茶素没食子酸酯母液采用0.22μm滤膜过滤除菌；所述儿茶素没食子酸酯添加的终浓度为1～10mg/L，进一步优选为2～5mg/L，更进一步优选为4～5mg/L。所述步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种添加儿茶素没食子酸酯提高变色栓菌漆酶产量的方法，其特征在于按照下述步骤进行/n(1)将预培养的变色栓菌菌丝体接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养；/n(2)在所述发酵培养过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加儿茶素没食子酸酯溶液；/n(3)在菌丝体对数生长期结束并进入漆酶主要合成阶段后，选择适于漆酶表达和分泌的发酵培养条件和发酵培养时间，并继续培养以产生漆酶；/n(4)培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集固态发酵基质。/n

【技术特征摘要】
1.一种添加儿茶素没食子酸酯提高变色栓菌漆酶产量的方法，其特征在于按照下述步骤进行
(1)将预培养的变色栓菌菌丝体接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养；
(2)在所述发酵培养过程的菌丝体生长阶段，向发酵液中添加儿茶素没食子酸酯溶液；
(3)在菌丝体对数生长期结束并进入漆酶主要合成阶段后，选择适于漆酶表达和分泌的发酵培养条件和发酵培养时间，并继续培养以产生漆酶；
(4)培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集固态发酵基质。


2.根据权利要求所述的一种添加儿茶素没食子酸酯提高变色栓菌漆酶产量的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述变色栓菌菌丝体预培养物培养方法，按照下述步骤进行：
斜面菌丝体的活化方法如下：采用常用土豆葡萄糖琼脂(PDA)培养基配置方法配制斜面菌丝体活化用培养基，其中土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L；将变色栓菌(CICC14001)菌丝(0.5cmx1cm)1块接种到该培养基试管斜面上，30℃培养7天；
采用常用土豆葡萄糖培养基配制方法配制菌丝预培养用的培养基，其中土豆200g/L、葡萄糖20g/L；将活化后的斜面菌丝体(0.5cmx1cm)3块接种于100mL土豆葡萄糖培养基中，于25℃、150r/min条件下培养7天；将该培养物均质后按10％(v/v)接种量再次转接入新鲜的土豆葡萄糖培养基中，于25℃、150r/min条件下培养5天，即得预培养的菌丝体，用于漆酶固态发酵。


3.根据权利要求所述的一种添加儿茶素没食子酸酯提高变色栓菌漆酶产量的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述漆酶固态发酵培养基：麦麸和基础无机盐培养基按1:3(w/w)比例混合；其中基础无机盐培养基组成为Ca(NO3)2.4H2O0.5g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4.7H2O0.5g/L，其余为水。


4.根据权利要求所述的一种添加儿茶素没食子酸酯提高变色栓菌漆酶产量的方法，其特征在于所述步骤(1)中发酵培养的具体条件：发酵培养基起始pH为6.1～8.0，优选为6.5～7.5，更优选为6.5～7.0。


5.根据权利要求所述的一种添加儿茶素没食子酸酯提高变色栓菌漆酶产量的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述变色栓菌菌丝体接种后发酵基质中的初始生物量为0.02～0.15mg/g，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王锋，李湘，徐玲，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32