一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过金藻发酵高效生产水溶性β‑1,3‑葡聚糖的方法，该方法以高含水溶性β‑1,3‑葡聚糖的金藻为发酵培养的微生物，生产水溶性β‑1,3‑葡聚糖的金藻藻种；其包括在发酵基础培养基中接种金藻藻种，发酵培养过程中流加补料培养基；通过调控发酵培养基中氮源种类、发酵培养基中C/N比、发酵培养基中葡萄糖浓度维持在一定范围的方式来调控金藻细胞生长速度和细胞密度，以获得高生物量浓度和高细胞密度的金藻发酵培养液，从而提高金藻细胞水溶性中β‑1,3‑葡聚糖的产量。本发明专利技术一方面解决现有β‑1,3‑葡聚糖来源中β‑1,3‑葡聚糖含量低、提取成本高、大多为水不溶性的问题；还解决现有限氮或缺氮方式提高微藻细胞中储存性多糖含量时细胞生长受到抑制的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法
本专利技术属于微藻培养领域，涉及一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法。
技术介绍
β-1,3-葡聚糖是一类广泛存在于微生物、植物和动物体内的大分子多糖，主链结构由β-1,3-糖苷键连接，通常因来源不同而含有不同比例和大小的β-1,3、β-1,4或β-1,6键连接的支链，主要以细胞结构成分如细胞壁的形式存在。β-1,3-葡聚糖是一种活性强、毒副作用低的高效生物应答物，不仅有免疫促进作用，而且具有抗肿瘤、抗感染等活性。在饲料行业，水溶性酵母β-1,3-葡聚糖可作为饲料添加剂，能起到提高动物非特异性和特异性免疫的作用。目前，β-葡聚糖主要来源是从香菇、酵母、燕麦、青稞中提取获得。一方面，这些原料中β-葡聚糖含量低，使得提取过程复杂、生产成本高；另外β-1,3-葡聚糖产量受这些原料生产规模、生产周期的限制，通过这种方式生产的β-葡聚糖产量和品质难以满足市场需求。此外，目前大多数β-1,3-葡聚糖(包括裸藻副淀粉在内的)具有水不溶性、黏度大的特征，其活性较低。因此，如何能够高效且经济地生产制备水溶性β-1,3-葡聚糖，将能够有效推进β-1,3-葡聚糖在医药、动物饲料等方面的应用。朱顺妮、王亚杰、黄伟等人文章(ShunniZhu,YajieWang,WeiHuang,JinXu,ZhongmingWang,JingliangXu,ZhenhongYuan.EnhancedaccumulationofcarbohydrateandstarchinChlorellazofingiensisinducedbynitrogenstarvation.AppliedBiochemistryandBiotechnology,2014,174:2435–2445.)采用氮饥饿诱导方式提高小球藻胞内碳水化合物和多糖淀粉的含量，研究结果表明氮饥饿能快速诱导小球藻胞内碳水化合物尤其是淀粉的积累，氮饥饿诱导1天小球藻胞内碳水化合物和淀粉含量分别增加了37％和4倍。氮饥饿诱导条件下胞内最高碳水化合物含量占细胞干重的66.9％，碳水化合物中66.7％为淀粉。但是，缺氮培养下小球藻的细胞比生长速度和生物量浓度明显下降，缺氮诱导下小球藻的比生长速度为0.48d-1，远低于富氮培养条件下的比生长速度(1.02d-1)。由此可见氮饥饿诱导虽然可提高小球藻胞内碳水化合物和多糖淀粉的含量，但同时需要以严重牺牲生长速度和生物量为代价。在提高微藻细胞多糖含量方面，现有的限氮或氮饥饿诱导方式提高微藻细胞中储存性多糖(如淀粉)含量下细胞生长受到抑制，多糖产量难以提高，不适宜工业生产。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题鉴于现有技术的上述缺点、不足，本专利技术提供一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法，能够经济、高效地生产水溶性β-1,3-葡聚糖。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：第一方面，本专利技术实施例提供一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法，以高含水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻为发酵培养的微生物，生产水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻藻种；其包括：在发酵基础培养基中接种金藻藻种，发酵培养过程中流加补料培养基，补料培养基加到发酵体系中构成发酵培养基；通过调控发酵培养基中氮源种类、发酵培养基中C/N比、发酵培养基中葡萄糖浓度维持在一定范围的方式来调控金藻细胞生长速度和细胞密度，以获得高生物量浓度、高细胞密度的金藻发酵培养液，从而提高金藻细胞水溶性中β-1,3-葡聚糖的产量。根据本专利技术的较佳实施例，其中，所述发酵基础培养基和补料培养基中均含有碳源和氮源，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为有机氮源或采用有机氮源和无机氮源的混合氮源；所述发酵基础培养基中葡萄糖浓度为5-15g/L，所述发酵基础培养基和补料培养基中C/N＝4:1-40:1；监控发酵体系中发酵培养基的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度较初始浓度下降0.5-3g/L时，使用速度可调的蠕动泵流加补料培养基进行流加培养，并适时监控测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适时调节补料速度，控制整个流加培养过程中发酵培养基的葡萄糖浓度为1-10g/L；控制发酵过程中发酵培养基C/N＝4:1-40:1；当连续两次取样样品发酵干重不变或开始下降时，发酵结束。根据本专利技术的较佳实施例，其中，所述有机氮源为酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种；所述混合氮源为尿素/NH4Cl，与酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种混合而成的氮源。例如为尿素与酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种混合，或者为NH4Cl与酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种混合。根据本专利技术的较佳实施例，其中，发酵培养过程中，培养温度25-32℃，通风比为0.5-2:1(vvm)，培养过程中搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧控制在5-80％；控制发酵培养基的pH为4-8。根据本专利技术的较佳实施例，其中，pH采用3MNaOH或1MHCl调控至pH＝4-8。根据本专利技术的较佳实施例，其中，所述发酵基础培养基中含有：葡萄糖5-15g/L、酵母粉0.1-5g/L、肝浸粉0.1-5g/L、KH2PO40.1-0.5g/L、NH4Cl0-2g/L、MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L、FeCl3+EDTA母液0.1-1mL/L、CaCl2母液0.1-1mL/L、微量元素母液0.1-1mL/L、维生素B10.1-5mg/L和维生素B120.1-5mg/L、调pH4-8；所述微量元素母液含有硼、锌、锰、钼、钴的金属阳离子或金属酸根离子。根据本专利技术的较佳实施例，其中，所述补料培养基中含有：葡萄糖200-500g/L、酵母粉10-50g/L、肝浸粉10-50g/L、KH2PO45-50g/L、NH4Cl0-50g/L、MgSO4·7H2O5-50g/L、FeCl3+EDTA母液10-50mL/L、CaCl2·2H2O母液10-50mL/L，微量元素母液10-50mL/L、维生素B10.1-50mg/L；维生素B120.1-50mg/L。根据本专利技术的较佳实施例，其中，FeCl3+EDTA母液含有3.7～3.8g/L的FeCl3、和8.5-9g/L的Na2-EDTA；CaCl2母液含108-115g/L的CaCl2；微量元素母液含1.9-2.0g/L的H3BO3、0.02-0.024g/L的ZnSO4、0.2-0.24g/L的MnCl2、0.009-0.012g/L的Na2MoO4和0.014-0.016g/L的Co(NO3)2。根据本专利技术的较佳实施例，其中，所述发酵培养金藻的步骤如下：S1:摇瓶种子培养在无菌环境下，将经摇瓶活化后的金藻细胞以2-10％接种量(v/v)接种于摇瓶中进行振荡暗培养，培养温度25-32℃，转速120-220rpm，培养时间2-5天；S2:将培养好的摇瓶种子液以5-10％(v/v)接种量接种于发酵罐的发酵基础培养基中，保持培养温度25-32本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法，其特征在于，以高含水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻为发酵培养的微生物，生产水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻藻种；其包括：/n在发酵基础培养基中接种金藻藻种，发酵培养过程中流加补料培养基，补料培养基加到发酵体系中构成发酵培养基；通过调控发酵培养基中氮源种类、发酵培养基中C/N比、发酵培养基中葡萄糖浓度维持在一定范围的方式来调控金藻细胞生长速度和细胞密度，以获得高生物量浓度和高细胞密度的金藻发酵培养液，从而提高金藻细胞水溶性中β-1,3-葡聚糖的产量。/n

【技术特征摘要】
1.一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法，其特征在于，以高含水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻为发酵培养的微生物，生产水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻藻种；其包括：
在发酵基础培养基中接种金藻藻种，发酵培养过程中流加补料培养基，补料培养基加到发酵体系中构成发酵培养基；通过调控发酵培养基中氮源种类、发酵培养基中C/N比、发酵培养基中葡萄糖浓度维持在一定范围的方式来调控金藻细胞生长速度和细胞密度，以获得高生物量浓度和高细胞密度的金藻发酵培养液，从而提高金藻细胞水溶性中β-1,3-葡聚糖的产量。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵基础培养基和补料培养基中均含有碳源和氮源，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为有机氮源或采用有机氮源和无机氮源的混合氮源；所述发酵基础培养基中葡萄糖浓度为5-15g/L，所述发酵基础培养基和补料培养基中C/N＝4:1-40:1；
监控发酵体系中发酵培养基的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度较初始浓度下降0.5-3g/L时，使用速度可调的蠕动泵流加补料培养基进行流加培养，并适时监控测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适时调节补料速度，控制整个流加培养过程中发酵培养基的葡萄糖浓度为1-10g/L；控制发酵过程中发酵培养基C/N＝4:1-40:1；
当连续两次取样样品发酵干重不变或开始下降时，发酵结束。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述有机氮源为酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种；所述混合氮源为尿素/NH4Cl，与酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种混合而成的氮源。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养过程中，培养温度25-32℃，通风比为0.5-2:1(vvm)，培养过程中搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧控制在5-80％；控制发酵培养基的pH为4-8。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，pH采用3MNaOH或1MHCl调控至pH＝4-8。


6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵基础培养基中含有：葡萄糖5-15g/L、酵母粉0.1-5g/L、肝浸粉0.1-5g/L、KH2PO40.1-0.5g/L、NH4Cl0-2g/L、MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L、FeCl3+EDTA母液0.1-1mL/L、CaCl2母液0.1-1mL/L、微量元素母液0.1-1mL/L、维生素B10.1-5mg/L和维生素B120.1-5mg/L、调pH4-8；所述微量元素母液含有硼、锌、锰、钼、钴的金属阳离子或金属酸根离子。


7.根据权利要求2所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：金虎，陈剑平，马明洋，李艳华，韩丹翔，胡强，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42