一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法技术

本发明专利技术属于微生物筛选技术领域，尤其涉及一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，包括步骤：四环素类抗生素储存液、若干份液态富集培养基和若干份固态选择培养基配制；若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基和固态选择培养基的制备；家用净水器滤芯中四环素类抗菌的分离和纯化。相比于现有技术，本发明专利技术操作简便易行，安全环保，能够有效地筛选到目的细菌。

【技术实现步骤摘要】
一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法
本专利技术属于微生物筛选
，尤其涉及一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法。
技术介绍
近些年来，大量不合理的抗生素的使用导致在地下水、土壤、空气的抗性细菌的种类和数目越来越多，并开始由单一耐药性逐渐进化为多重耐药性，甚至饮用水中都能检测抗性细菌的存在。自来水中的抗生素可能诱导抗生素抗性微生物富集，抗性基因可通过水平转移使微生物获得多重抗生素抗性，“超级细菌”的出现更是给人体健康造成无法挽回的灾难。随着社会经济水平快速提升，消费者对饮用水的安全问题关注度越来越高，使得净水行业及净水技术得到迅猛发展，滤芯是净水器净水效果的核心所在，因此滤芯的生物安全逐渐受到学者的广泛重视。目前对于净水器滤芯中是否存在抗生素抗性菌的研究很少，比较多的还是环境水体中抗性菌的筛选和培养，而无法判断居民家中最常见的净水设备中是否存在生物风险。有鉴于此，确有必要提供一种从家用净水器滤芯中筛选抗生素抗性菌的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：针对现有技术的不足，而提供一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，操作简便易行，安全环保，能够有效地筛选到目的细菌。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，包括以下步骤：1)在无菌条件下，配制四环素类抗生素储存液、若干份液态富集培养基和若干份固态选择培养基；2)往每份所述液态富集培养基中加入不等量的四环素类抗生素储存液，得到若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基；3)往每份所述固态选择培养基中加入不等量的四环素类抗生素储存液，得到若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的固态选择培养基；4)取家用净水器的滤芯放入无菌水中，室温下振荡培养后，取上清液加入到步骤2)所得的若干份液态富集培养基中，于30℃恒温振荡培养，得到若干份菌悬液；5)将若干份所述菌悬液进行若干次离心清洗，去除上层培养基，得到若干份清洗干净的富集培养液；6)先对步骤3)得到的若干固态选择培养基进行高压灭菌处理，再进行倒平板后置于生化培养箱中；7)用灭菌生理盐水稀释步骤5)得到的富集培养液后，将其滴加到经过倒平板且具有相应四环素类抗生素浓度的固态选择培养基中，均匀涂布，于30℃恒温生化培养箱培养，生长出菌落，将菌落纯化后得到初筛四环素类抗性单菌落；8)分别取每种初筛四环素类抗性单菌落1环接种于步骤2)所得的含有一定浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基中，30～35℃下培养8～10h，再将得到的富集培养液用无菌水稀释，然后分别取稀释后的富集培养液滴到含有相应四环素类抗生素浓度的固体选择培养基上，均匀涂布，30～35℃下倒置培养24～48h，得到的菌株即为复筛四环素类抗性菌株；9)将得到的复筛四环素类抗性菌株接种于含有四环素类抗生素的固体选择培养基上，驯化转接3～5次，能生长保持良好的菌落，即为四环素类抗性菌。需要说明的是，本专利技术之所以选择四环素类选择培养基是利用微生物对四环素的抗性的原理，只允许抗性菌生长，并同时抑制或阻止其他微生物生长。除了常见的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及厌氧菌外，多数立克次体属、支原体属、衣原体属等也对本品过敏。四环素的作用机制在于药物能特异性地与细菌核糖体30s亚基的A位置结合，阻止氨基酰-tRNA在该位上的联结，从而抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。因此，通过在培养基中按最低抑菌浓度侵入四环素类抗生素筛选抗生素抗性微生物。作为本专利技术所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，所述四环素类抗生素储存液的制备方法为：使用无水乙醇配制，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装后于-20℃下避光保存，保存时间不超过30天。作为本专利技术所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，所述液态富集培养基的制备方法为：称取蛋白胨、酵母粉和NaCl，加入超纯水定容，溶解并不断搅拌，于120℃下高压灭菌，再放入45±1℃的水浴箱冷却待用。作为本专利技术所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，所述固态选择培养基的制备方法为：称取蛋白胨、酵母粉、NaCl和琼脂，加入超纯水定容，溶解并不断搅拌，于120℃下高压灭菌。作为本专利技术所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，在步骤2)中，若干份所述液态富集培养基中，含有的四环素类抗生素的浓度成梯度关系，第N份所述液态富集培养基中含有的四环素类抗生素的浓度为第N-1份所述液态富集培养基中含有的四环素类抗生素的浓度的1.5～5倍，N≥2。作为本专利技术所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，在步骤3)中，若干份所述固态选择培养基中，含有的四环素类抗生素的浓度成梯度关系，第N份所述固态选择培养基中含有的四环素类抗生素的浓度为第N-1份所述固态选择培养基中含有的四环素类抗生素的浓度的1.5～5倍，N≥2。作为本专利技术所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，在步骤4)中，以200r/min的转速在室温下振荡培养0.5～2h；以150r/min的转速在30℃恒温下振荡培养10天。作为本专利技术所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法的一种改进，在步骤5)中，以5000r/min的转速离心5min后，去除上层培养基，再加入生理盐水，以5000r/min的转速离心5min，重复离心清洗3次。相比于现有技术，本专利技术的有益效果包括但不限于：1)本专利技术利用细菌对四环素类抗生素的耐受性，以家用净水器滤芯作为分离源，有效地筛选到目的细菌，提高了筛菌的效率。2)本专利技术提供的这种抗性菌筛选方法，采用了富集分离的培养方式，从滤芯中筛选出具有四环素类抗性的微生物，具有操作简便易行，准确率高，安全环保，筛选结果理想的效果，适用于不同品牌和原理净水器滤芯中某类抗生素抗性细菌的快速分析。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式并不限于此。1)以下实施例中，除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和试剂如下：设备：A.恒温培养箱：36℃士1℃。B.冰箱：2℃～5℃。C.电子天平：感量0.01g。D.涡旋振荡器。E.无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。F.离心管：2mL(具0.01mL刻度)、50mL(具1mL刻度)。G.无菌锥形瓶：容量100mL、250mL、1000mL。H.无菌培养皿：直径90mm。I.注射器：2mL。J.紫外灯：波长360nm～366nm，功率≤6W。K.使用超过一年的美的牌五级超滤净水器第二级颗粒活性炭滤芯。L.镊子，涂布刀，接种环。材料：A.蛋白胨；B.酵母粉；C.琼脂；D.氯化钠；E.四环素；F金霉素；G.超纯水。以上取样工具及相关试剂材料应提前准备、灭菌。颗粒活性炭滤芯生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)在无菌条件下，配制四环素类抗生素储存液、若干份液态富集培养基和若干份固态选择培养基；/n2)往每份所述液态富集培养基中加入不等量的四环素类抗生素储存液，得到若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基；/n3)往每份所述固态选择培养基中加入不等量的四环素类抗生素储存液，得到若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的固态选择培养基；/n4)取家用净水器的滤芯放入无菌水中，室温下振荡培养后，取上清液加入到步骤2)所得的若干份液态富集培养基中，于30℃恒温振荡培养，得到若干份菌悬液；/n5)将若干份所述菌悬液进行若干次离心清洗，去除上层培养基，得到若干份清洗干净的富集培养液；/n6)先对步骤3)得到的若干固态选择培养基进行高压灭菌处理，再进行倒平板后置于生化培养箱中；/n7)用灭菌生理盐水稀释步骤5)得到的富集培养液后，将其滴加到经过倒平板且具有相应四环素类抗生素浓度的固态选择培养基中，均匀涂布，于30℃恒温生化培养箱培养，生长出菌落，将菌落纯化后得到初筛四环素类抗性单菌落；/n8)分别取每种初筛四环素类抗性单菌落1环接种于步骤2)所得的含有一定浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基中，30～35℃下培养8～10h，再将得到的富集培养液用无菌水稀释，然后分别取稀释后的富集培养液滴到含有相应四环素类抗生素浓度的固体选择培养基上，均匀涂布，30～35℃下倒置培养24～48h，得到的菌株即为复筛四环素类抗性菌株；/n9)将得到的复筛四环素类抗性菌株接种于含有四环素类抗生素的固体选择培养基上，驯化转接3～5次，能生长保持良好的菌落，即为四环素类抗性菌。/n...

【技术特征摘要】
1.一种从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在无菌条件下，配制四环素类抗生素储存液、若干份液态富集培养基和若干份固态选择培养基；
2)往每份所述液态富集培养基中加入不等量的四环素类抗生素储存液，得到若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基；
3)往每份所述固态选择培养基中加入不等量的四环素类抗生素储存液，得到若干份含有不同浓度的四环素类抗生素的固态选择培养基；
4)取家用净水器的滤芯放入无菌水中，室温下振荡培养后，取上清液加入到步骤2)所得的若干份液态富集培养基中，于30℃恒温振荡培养，得到若干份菌悬液；
5)将若干份所述菌悬液进行若干次离心清洗，去除上层培养基，得到若干份清洗干净的富集培养液；
6)先对步骤3)得到的若干固态选择培养基进行高压灭菌处理，再进行倒平板后置于生化培养箱中；
7)用灭菌生理盐水稀释步骤5)得到的富集培养液后，将其滴加到经过倒平板且具有相应四环素类抗生素浓度的固态选择培养基中，均匀涂布，于30℃恒温生化培养箱培养，生长出菌落，将菌落纯化后得到初筛四环素类抗性单菌落；
8)分别取每种初筛四环素类抗性单菌落1环接种于步骤2)所得的含有一定浓度的四环素类抗生素的液态富集培养基中，30～35℃下培养8～10h，再将得到的富集培养液用无菌水稀释，然后分别取稀释后的富集培养液滴到含有相应四环素类抗生素浓度的固体选择培养基上，均匀涂布，30～35℃下倒置培养24～48h，得到的菌株即为复筛四环素类抗性菌株；
9)将得到的复筛四环素类抗性菌株接种于含有四环素类抗生素的固体选择培养基上，驯化转接3～5次，能生长保持良好的菌落，即为四环素类抗性菌。


2.根据权利要求1所述的从家用净水器滤芯中筛选四环素类抗性菌的方法，其特征在于，所述四环素类抗生素储存液的制备方法为：使用无水乙醇配制，经0.22μm...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟洪艳，程胜梓，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12