特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法技术

本发明专利技术提出一种特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，属于菌株选育领域。该选育方法包括：筛选出发菌株、筛选初筛菌株、初筛菌株的适应性进行培养及菌株评价试验等步骤。利用本发明专利技术提供的高效选育方法筛选得到一株特高浓啤酒酵母菌株TG‑01，其保藏编号为CGMCC No.19839，于2020年05月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明专利技术通过通过建立特定胁迫条件高效筛选和适应性进化筛选相结合的方法，将2‑脱氧‑D‑葡萄糖、山梨醇及酒精三者结合在一起模拟出高于大生产的特高浓发酵环境的胁迫条件，能够进一步定向高效的筛选出对葡萄糖不敏感、耐高渗、耐酒精的目标菌株。在菌株选育领域具有十分广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法
本专利技术属于菌株选育领域，尤其涉及一种特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法。
技术介绍
超高浓酿造技术是国内外啤酒行业发展的新趋势，可大幅度降低能耗、提高设备利用率，且麦汁浓度越高，优势越突出。与高浓酿造相比，特高浓酿造(≥22°P)对酵母菌株提出了更高的技术要求和难度，如特高浓麦汁、高渗透压等环境会影响酵母正常的生理生化特征，降低酵母活力及发酵性能，最终影响啤酒的风味及协调性。因此实现特高浓酿造技术的前提是选育出能够适用于发酵特高浓麦汁、抵抗高渗透压、高酒精度且性能良好的酵母。目前，国内有报道通过化学诱变、培养分离、高酒精环境驯化等方法筛选出能发酵28°P特高浓麦汁的酵母菌株，该方法不仅存在发酵周期较长、步骤繁琐、筛选效率低等缺陷，同时难以适应更高浓度的麦汁发酵环境。因此，如何开发出一种操作简便、性能良好、筛选效率高的特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法是本领域技术人员亟待解决的一项课题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的发酵周期较长、步骤繁琐、筛选效率低等问题，提出一种操作简便、筛选效率高、性能良好的的特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，所述方法具体步骤如下：将备选菌株涂布于添加乙醇和山梨醇的YPD固体培养基上，根据所述备选菌株的生长速度，筛选得到出发菌株；将所述出发菌株在YPD液体培养基中培养，将菌悬液涂布于初筛培养基上待其长出单菌落后，挑取单菌落转至低浓度麦汁中培养，得到初筛菌株；对所述初筛菌株进行适应性进化培养，得到复筛菌株；对所述复筛菌株进行菌株评价试验，根据其生长速度，筛选得到特高浓啤酒酵母菌株。作为优选，所述适应性进化复筛步骤具体为：将所述初筛菌株接种至添加特高浓麦汁的麦汁培养基中培养后，将菌液加入全自动高通量微生物液滴培养仪中，在适应性进化模式下培养，生成液滴；将所述液滴转入添加乙醇的麦汁培养基中，通过提高乙醇的浓度，进行菌株驯化，根据其生长速度，筛选得到复筛菌株。作为优选，所述特高浓麦汁的浓度为26-32°P，所述麦汁培养基中无水乙醇的添加量为6-16％。作为优选，所述特高浓麦汁是通过以下方法制备得到的：通过向20°P普通麦汁中添加糖浆和氨基氮富集剂，以调整麦汁糖度和氨基氮含量，得到浓度为26-32°P的特高浓麦汁；其中，所述特高浓麦汁中氨基氮的含量为300-350mg/L。作为优选，所述添加酒精和山梨醇的YPD固体培养基配方为：酵母浸出物0.5-2％、蛋白胨1-3％、麦芽糖0.5-2％、无水乙醇6-10％、山梨醇20-30％、琼脂2％；YPD液体培养基配方为：酵母浸出物0.5-2％、蛋白胨1-3％、麦芽糖0.5-2％；初筛培养基的配方为：酵母浸出物0.5-2％、蛋白胨1-3％、麦芽糖0.5-2％、无水乙醇6-10％、山梨醇20-30％、2-脱氧-D-葡萄糖0.05-2％、琼脂2％。作为优选，所述添加酒精和山梨醇的YPD固体培养基配方为：酵母浸出物1％、蛋白胨2％、麦芽糖1％、无水乙醇10％、山梨醇30％、琼脂2％；所述初筛培养基的配方为：酵母浸出物1％、蛋白胨2％、麦芽糖1％、无水乙醇10％、山梨醇30％、2-脱氧-D-葡萄糖0.05％、琼脂2％。作为优选，所述出发菌株在YPD液体培养基中的培养条件为：25-28℃培养48-60h，每天震荡2-3次。作为优选，所述菌悬液涂布于初筛培养基上的培养条件为：25-28℃培养10-14天，所述低浓度麦汁的浓度为10-12°P。作为优选，所述菌株评价试验包括EBC管发酵试验、2L发酵试验和10L发酵试验。利用上述任一优选技术方案所述的高效选育方法筛选得到一种特高浓啤酒酵母菌株TG-01，其保藏编号为CGMCCNo.19839，分类命名为Saccharomycespastorianus，于2020年05月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：1、本专利技术提供了一种特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，通过建立特定胁迫条件高效筛选和适应性进化筛选相结合的方法，将2-脱氧-D-葡萄糖、山梨醇及酒精三者结合在一起模拟出高于大生产的特高浓发酵环境的胁迫条件，能够进一步定向高效的筛选出对葡萄糖不敏感、耐高渗、耐酒精的目标菌株；2、本专利技术提供了一种特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，整个筛选流程步骤简单、筛选过程高效、选育出的菌株能够很好的适应中试以上生产规模，能够在特高浓(26-32°P)啤酒酿造中得到很好的应用。附图说明图1为本专利技术实施例所提供的现有菌株在不同浓度麦汁中的发酵度结果图；图2为本专利技术实施例所提供的复筛菌株EBC管发酵的发酵度结果图；图3为本专利技术实施例所提供的利用复筛菌株所得冷贮啤酒成熟度结果示意图，其中，图A为冷贮啤酒的双乙酰含量，图B为冷贮啤酒的乙醛含量；图4为本专利技术实施例所提供的复筛菌株的死亡率结果图；图5为本专利技术实施例所提供的编号21#、61#的酵母菌株遗传稳定性实验验证结果，其中图A为编号21#、61#的酵母菌株传代前后所得啤酒的发酵度、图B为编号21#、61#的酵母菌株传代前后所得啤酒的双乙酰含量、图C为编号21#、61#的酵母菌株传代前后所得啤酒的乙醛含量、图D为编号21#、61#的酵母菌株传代前后所得啤酒的醇酯比；图6为本专利技术实施例所提供的酵母菌株2L发酵规模下的发酵性能测定结果图，其中，图A为编号21#、61#的酵母菌株所得啤酒的发酵度、图B为编号21#、61#的酵母菌株所得啤酒的双乙酰含量、图C为编号21#、61#的酵母菌株所得啤酒的乙醛含量、图D为编号21#、61#的酵母菌株所得啤酒的总醇含量、图E为编号21#、61#的酵母菌株所得啤酒的总酯含量、图F为编号21#、61#的酵母菌株所得啤酒的醇酯比含量。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例提供了一种特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，所述方法具体步骤如下：将备选菌株涂布于添加乙醇和山梨醇的YPD固体培养基上，根据所述备选菌株的生长速度，筛选得到出发菌株；将所述出发菌株在YPD液体培养基中培养，将菌悬液涂布于初筛培养基上待其长出单菌落后，挑取单菌落转至低浓度麦汁中培养，得到初筛菌株；对所述初筛菌株进行适应性进化培养，得到复筛菌株；对所述复筛菌株进行菌株评价试验，根据其生长速度，筛选得到特高浓啤酒酵母菌株。在上述选育方法中，并未选择化学诱变或物理诱变的方法对待本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：/n将备选菌株涂布于添加乙醇和山梨醇的YPD固体培养基上，根据所述备选菌株的生长速度，筛选得到出发菌株；/n将所述出发菌株在YPD液体培养基中培养，将菌悬液涂布于初筛培养基上待其长出单菌落后，挑取单菌落转至低浓度麦汁中培养，得到初筛菌株；/n对所述初筛菌株进行适应性进化培养，得到复筛菌株；/n对所述复筛菌株进行菌株评价试验，根据其生长速度，筛选得到特高浓啤酒酵母菌株。/n

【技术特征摘要】
1.特高浓啤酒酵母菌株的高效选育方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
将备选菌株涂布于添加乙醇和山梨醇的YPD固体培养基上，根据所述备选菌株的生长速度，筛选得到出发菌株；
将所述出发菌株在YPD液体培养基中培养，将菌悬液涂布于初筛培养基上待其长出单菌落后，挑取单菌落转至低浓度麦汁中培养，得到初筛菌株；
对所述初筛菌株进行适应性进化培养，得到复筛菌株；
对所述复筛菌株进行菌株评价试验，根据其生长速度，筛选得到特高浓啤酒酵母菌株。


2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所述适应性进化培养的步骤具体为：
将所述初筛菌株接种至添加特高浓麦汁的麦汁培养基中培养后，将菌液加入全自动高通量微生物液滴培养仪中，在适应性进化模式下培养，生成液滴；
将所述液滴转入添加乙醇的麦汁培养基中，通过提高乙醇的浓度，进行菌株驯化，根据其生长速度，筛选得到复筛菌株。


3.根据权利要求2所述的选育方法，其特征在于，所述特高浓麦汁的浓度为26-32°P，所述麦汁培养基中无水乙醇的添加量为6-16％。


4.根据权利要求3所述的选育方法，其特征在于，所述特高浓麦汁是通过以下方法制备得到的：
通过向20°P普通麦汁中添加糖浆和氨基氮富集剂，以调整麦汁糖度和氨基氮含量，得到浓度为26-32°P的特高浓麦汁；
其中，所述特高浓麦汁中氨基氮的含量为300-350mg/L。


5.根据权利要求1所述的选育方法，其特征在于，所述添加酒精和山梨醇的YPD固...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹花，董建军，余俊红，陈璐，万秀娟，赵玉祥，陈嵘，侯晓平，贺扬，
申请(专利权)人：青岛啤酒股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37