一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用，属于环境微生物领域。具体过程为：选取至少2种菌种，富集培养后，在以目标污染物为单一碳源和能源的无机盐培养驯化，利用2,6‑二氯酚靛酚生物试剂的颜色变化，连续监测菌液OD

【技术实现步骤摘要】
一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用
本专利技术涉及一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用，属于环境微生物领域。
技术介绍
微生物在环境中广泛存在，当环境受到石油烃类物质污染时，微生物为了生存会产生适应性变化，而不能适应环境变化的微生物被淘汰，从而留下能够降解石油的优势微生物。在未受污染的生态系统中，石油烃降解为生物所占比例不到0.1％，但在石油烃污染环境中，该比例会增加10-100倍。石油烃降解微生物被广泛地运用于石油污染物的治理和修复，包括细菌、真菌、放线菌以及藻类。其中细菌种类最多，也是最主要的降解活性物质，它们对石油烃组分的降解遵循优先降解顺序：正烷烃＞支链烷烃＞单方烃＞环烷烃＞芳香烃＞多环芳烃＞沥青烯烃等。为了对比不同微生物对石油碳氢化合物的代谢能力，本专利技术提供一种关于不同菌种对石油烃降解能力的比较方法。本专利技术能够在短时间内比较多种不同菌种对石油烃的降解能力。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题：针对现有判别降解菌对石油烃降解能力差异耗时较长的问题，提供了一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法及其应用。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：(1)菌种的来源：已公布的石油烃降解菌。(2)菌种的活化培养：选取至少2种菌种，分别投入100mL灭菌的LB液体培养基中，并添加1％的原油，富集培养3-7d。(3)菌种的驯化培养：分别在以葡萄糖、十六烷、菲和石油烃混合物为单一碳源和能源的无机盐培养基中加入1％富集培养的菌液，36℃，120rpm，培养3-7d。(4)菌悬液配制：取50mL菌液于灭菌的离心管，4000转，离心10min，弃去上清液，用灭菌的生理盐水50mL悬浮沉淀物后再次离心，如上所述洗涤3次后，用紫外分光光度计测定菌悬液浓度。(5)菌种生长曲线：用酶标仪连续测定菌液的OD600，绘制菌种的生长曲线，确定不同菌种对石油烃降解能力。进一步的，所述的LB液体培养基，其特征在于，LB液体培养基的成分为胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，pH值：7.0-7.4。进一步的，所述的无机盐培养基，其特征在于，无机盐培养基的成分为KH2PO4：1.0g/L，K2HPO4：1.0g/L，NH4NO3：1.0g/L，MgSO4·7H2O：0.2g/L，FeCl3：0.05g/L，CaCl2·2H2O：0.02g/L，pH：6.8-7.2。进一步的，所述的菌悬液配制，其特征在于，实验操作均在超净工作台内或酒精灯附近完成，确保无空气中的杂菌污染。洗涤所使用的生理盐水需灭菌，移取菌悬液的注射器需灭菌。测定菌悬液浓度所使用的具塞比色皿使用前浸泡于70％的乙醇溶液中。以无菌的生理盐水为空白参比，测定洗涤后的菌液浓度，将菌悬液的OD600调至相一致。进一步的，所述菌液OD600的测定：在超净工作台内，用8道移液器分别移取5μL的葡萄糖、十六烷、菲和石油烃混合物于无菌96孔板，继续向上述96孔板中移取160μL的BH培养基、15μL的菌悬液和37.5μg/mL的2,6-DCPIP试剂20μL。将96孔板置于恒温培养箱中培养，用酶标仪在0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，48h，60h和72h测OD600。并观察对应时刻96孔板的颜色变化。本专利技术方法应用于比较不同菌种对其他含碳有机物污染物降解能力。本专利技术在获得石油烃降解微生物后，选取至少2种菌种，并选取葡萄糖、十六烷、菲和石油烃混合物4种有机物分别代表普通碳源、烷烃、芳香烃和复杂石油烃，通过菌液在不同碳源微环境中的吸光值绘制菌种的生长曲线，确定不同菌种对石油烃降解能力。附图说明图1为各菌种在葡萄糖微环境中的生长曲线。图2为各菌种在十六烷微环境中的生长曲线。图3为各菌种在菲的微环境中的生长曲线。图4为各菌种在石油烃微环境中的生长曲线。具体实施方式本实施例以海源菌属(J1)、阿尔蒂杆菌属(J2)、盐单胞菌属(J3)为例，结合实施例及附图，对本专利技术进行进一步详细说明。实施例1：由图1可知，J1、J2和J3均能较好的利用葡萄糖。3株菌对葡萄糖的利用能力：J1>J3>J2，J1和J2在36h对葡萄糖代谢完全，J3在12h对葡萄糖代谢完全。实施例2：由图2可知，J1和J3均能较好的利用十六烷，而J2对十六烷环境耐受性较差。3株菌对十六烷的降解能力：J1>J3>J2，均在24h达到最大生物量，24h后开始减少，可能十六烷已经代谢完全。实施例3：由图3可知，J1、J2和J3均能较好的利用菲，其中J3对菲的利用能力最强，J1和J2对菲的利用能力相当。实施例4：由图4可知，J1、J2和J3在石油烃混合物环境中的耐受性比在十六烷和菲环境中要更弱。但明显可看出J3在4h-12h的生物量迅速增长，证明该菌能降解石油烃混合物质，是石油烃优势降解菌。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法，其特征在于，其步骤如下：/n(1)菌种的活化培养：选取能降解石油烃的菌种，分别投入100mL灭菌的LB液体培养基中，并添加1％的原油，富集培养3-7d，制得富集培养的菌液；/n(2)菌种的驯化培养：分别在以葡萄糖、十六烷、菲和石油烃混合物为单一碳源和能源的无机盐培养基中加入1％步骤(1)制得的富集培养的菌液，36℃，120rpm，培养3-7d；/n(3)菌悬液配制：取50mL步骤(2)制得的菌液于灭菌的离心管，4000转，离心10min，弃去上清液，用灭菌的生理盐水50mL悬浮沉淀物后再次离心，如上所述洗涤3次后，用紫外分光光度计测定菌悬液浓度；/n(4)菌种生长曲线：用酶标仪连续测定菌液的OD

【技术特征摘要】
1.一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)菌种的活化培养：选取能降解石油烃的菌种，分别投入100mL灭菌的LB液体培养基中，并添加1％的原油，富集培养3-7d，制得富集培养的菌液；
(2)菌种的驯化培养：分别在以葡萄糖、十六烷、菲和石油烃混合物为单一碳源和能源的无机盐培养基中加入1％步骤(1)制得的富集培养的菌液，36℃，120rpm，培养3-7d；
(3)菌悬液配制：取50mL步骤(2)制得的菌液于灭菌的离心管，4000转，离心10min，弃去上清液，用灭菌的生理盐水50mL悬浮沉淀物后再次离心，如上所述洗涤3次后，用紫外分光光度计测定菌悬液浓度；
(4)菌种生长曲线：用酶标仪连续测定菌液的OD600，绘制菌液的生长曲线，确定不同菌种对石油烃降解能力。


2.如权利要求1所述的一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法，其特征在于，所述步骤(1)中的LB液体培养基的成分为胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L，NaCl：10g/L，pH值：7.0-7.4。


3.如权利要求1所述的一种不同菌种对石油烃降解能力的比较方法，其特征在于，所述步骤(2)中的无机盐培养基的成分为KH2PO4：1.0g/L，K2HPO4：1.0g/L，NH4NO3：1.0g/L，MgSO4·7...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭芃，弓亮，袁林杰，王超北，解庆林，申泰铭，
申请(专利权)人：桂林理工大学，
类型：发明
国别省市：广西;45