过表达CsFEX型大肠杆菌及应用和检测方法技术

本发明专利技术属于微生物检测领域，涉及一种过表达CsFEX型大肠杆菌及应用和检测方法，该检测方法包括：1）配制LB液体培养基和LB固体培养基；2）在固体培养基上划线接种过表达CsFEX型大肠杆菌并过夜培养；3）挑取单克隆菌落，加入液体培养液并培养；4）目的片段检测并测序，将测序成功的菌液转接到液体LB中并培养；5）配制含不同浓度氟的LB液体培养基；6）将步骤3）中所得到的菌液转接到含不同浓度氟LB液体培养基中培养；7）紫外检测含不同浓度氟培养液中大肠杆菌生长的OD600值；8）建立菌液生长OD值与氟含量的关系曲线和回归方程。本发明专利技术是为解决野生型大肠杆菌因本身耐氟能力有限而无法检测出较高的氟含量。

【技术实现步骤摘要】
过表达CsFEX型大肠杆菌及应用和检测方法
本专利技术属于微生物检测领域，涉及一种大肠杆菌的应用及检测方法，尤其涉及一种过表达CsFEX型大肠杆菌及应用和基于该大肠杆菌生长OD值检测溶液中氟含量的方法。
技术介绍
氟在环境中分布十分广泛，由于岩石的风化、自然火山的喷发、人类频繁活动的污染等，土壤、大气、地下水中均存在着一定量的氟。现代工业发展下的氟污染，主要包括电镀、金属加工等工业的含氟废水以及钢铁冶炼和煤炭燃烧过程中排放的氟化氢、四氟化硅等气态污染物，会污染土壤和地下水。人类主要通过饮食摄取氟，吸收的氟大约有一半用于人体骨骼的发育和牙齿的钙化。但若摄入过量的氟，体内多种酶的活性会受到干扰，钙、磷的代谢平衡会遭到破坏，人体患氟斑牙、氟骨症的风险会大大增加，甚至会导致人体瘫痪。饮水型氟中毒和饮茶型氟中毒是常见的两种氟中毒现象，饮水型氟中毒是分布最广泛、患病人数最多的一种类型，主要分布于淮河、秦岭、昆仑山以北的广大地区，与水体中的含氟量高有关。饮茶型氟中毒的现象主要分布在四川、新疆、甘肃等少数民族聚居地，与砖茶和边茶茶汤中溶出的氟含量偏高有关。目前常用的化学分析或仪器检测溶液中氟含量的方法大多成本高、操作复杂，因此利用大肠杆菌生长OD值来检测水体氟含量的方法就突显出其成本经济、简单快捷、精确度高的优势。但野生型大肠杆菌本身对氟的耐受性就存在一定的局限性，在高浓度氟污染的情况下可能就无法发挥其作用。近年来，已有专利技术在真核和原核生物中发现了氟输出蛋白。目前，确定的氟化物输出蛋白家族主要分为两个系统发育不相关的类别，其中的一类广泛分布的家族就包括细菌中的Fluc(crcB)和真核生物中的FEX。研究发现FEX蛋白在生物抵抗氟毒害方面起重要作用，CsFEX基因的过量表达能够通过减少氟在细胞中的累积来增强大肠杆菌的耐氟性。
技术实现思路
为了解决
技术介绍
中存的上述技术问题，本专利技术是为解决野生型大肠杆菌因本身耐氟能力有限而无法检测出较高的氟含量，而提供了一种过表达CsFEX型大肠杆菌，以及利用过表达CsFEX型大肠杆菌生长OD值检测溶液中氟含量的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了一种过表达CsFEX型大肠杆菌，所述过表达CsFEX型大肠杆菌是将CsFEX基因连接到表达载体pET-28a后得到pET-CsFEX重组质粒，把pET-CsFEX重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中得到过表达CsFEX型大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-CsFEX。本
技术实现思路
还包括所述的过表达CsFEX型大肠杆菌在氟含量检测中的应用。本
技术实现思路
还包括一种基于过表达CsFEX型大肠杆菌检测溶液中氟含量的方法，所述方法包括以下步骤：1)配制LB液体培养基和LB固体培养基；2)在LB固体培养基上划线接种过表达CsFEX型大肠杆菌并过夜培养；3)挑取单克隆菌落，加入LB液体培养液并培养；4)目的片段检测并测序，将其与从转录组(PRJNA315669)中筛选出的CsFEX基因比对，成功的菌液转接到液体LB中并培养；5)配制含不同浓度氟的LB液体培养基；6)将步骤4)中所得到的菌液转接到含不同浓度氟LB液体培养基中并培养；7)紫外检测含不同浓度氟培养液中大肠杆菌生长的OD600值；8)建立菌液生长OD值与氟含量的关系曲线和回归方程；所述回归方程的具体表达式是：y＝-0.0024x+1.5842；9)称取步骤1)的LB液体培养基，向其中加入未知浓度的氟，得到含有未知浓度氟的LB液体培养基，将步骤4)中得到的菌液以1：100～1000的比例转接到含有未知浓度氟的LB液体培养基中并在恒温37℃、220rpm下振荡培养12h，得到培养后的菌液；10)紫外检测步骤9)的培养后菌液中大肠杆菌生长的OD600值，根据步骤8)得到的回归方程，计算即可得到含有未知浓度氟的LB液体培养基中的氟浓度。其中，所述步骤1)中LB液体培养基的组分及含量是胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L；所述LB液体培养基的配制方式是：按比例称取LB液体培养基的各组分，120℃灭菌20min，待冷却至40～50℃后，以1：1000加入与转基因载体对应的抗生素，所述抗生素是卡那霉素；所述LB固体培养基的组分及含量是胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L，所述LB固体培养基的配制方式是：按比例称取LB固体培养基的各组分，120℃灭菌20min，待冷却至40～50℃后，以1：1000加入抗生素，所述抗生素是卡那霉素，倒入圆形培养皿中，在紫外灯下凝固。其中，所述步骤2)中过夜培养的具体实现方式是恒温37℃下过夜培养12h。其中，所述步骤3)的具体实现方式是在步骤2)的LB固体培养基挑取单克隆菌落，加入600～800μLLB液体培养液，恒温37℃、220rpm下振荡培养3～4h。其中，所述步骤4)的具体实现方式是：通过PCR扩增以及琼脂糖凝胶电泳对步骤3)的菌液进行目的片段检测，有预期条带后测序；将测序成功的菌液以1：100～1000的比例转接到步骤1)中的LB液体培养基中，恒温37℃、220rpm下振荡培养6～8h，直至OD600值为0.8～1。其中，所述步骤4)的转录组(PRJNA315669)数据是通过IlluminaHiSeqTM2000平台，对对照组(CK)和氟处理组茶树叶片进行测序得到的。其中，所述步骤5)的具体实现方式是：取步骤1)配制得到的LB液体培养基，向其中加入氟离子，分别配制成氟离子浓度分别为0mM、15mM、25mM、50mM的含氟LB液体培养基，并调节pH为7.0～7.4，120℃灭菌20min，待冷却至40～50℃后，以1：1000加入对应的抗生素，所述抗生素是卡那霉素。其中，所述步骤6)的具体实现方式是将步骤4)中培养的菌液以1：100～1000的比例转接到步骤5)配制得到的不同浓度的含氟LB液体培养基中，恒温37℃、220rpm下振荡培养12h；作为优选，所述步骤7)的具体实现方式是采用紫外分光光度计于波长600nm处检测步骤6)中不同浓度含氟LB液体培养基中大肠杆菌生长的OD600值；作为优选，所述步骤8)的具体实现方式是：根据步骤7)得到的数据，以步骤5)得到的培养液中的氟离子浓度为横坐标，相对应的转基因大肠杆菌生长OD值为纵坐标，建立关系曲线，并得到二元一次线性回归方程，y＝-0.0024x+1.5842。本专利技术的优点是：一种利用过表达CsFEX型大肠杆菌生长OD值检测溶液中氟含量的方法，它涉及一种检测溶液中氟含量的方法。本专利技术是为解决野生型大肠杆菌因本身耐氟能力有限而无法检测出较高的氟含量的问题。检测方法如下：1)配制LB液体培养基和LB固体培养基；2)在LB固体培养基上划线接种过表达CsFEX型大肠杆菌并过夜培养；3)挑取单克隆菌落，加入LB液体培养液并培养；4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种过表达CsFEX型大肠杆菌，其特征在于：所述过表达CsFEX型大肠杆菌是将CsFEX基因连接到表达载体pET-28a后得到pET-CsFEX重组质粒，把pET-CsFEX重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中得到过表达CsFEX型大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-CsFEX。/n

【技术特征摘要】
1.一种过表达CsFEX型大肠杆菌，其特征在于：所述过表达CsFEX型大肠杆菌是将CsFEX基因连接到表达载体pET-28a后得到pET-CsFEX重组质粒，把pET-CsFEX重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中得到过表达CsFEX型大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-CsFEX。


2.权利要求1所述的过表达CsFEX型大肠杆菌在氟含量检测中的应用。


3.一种基于过表达CsFEX型大肠杆菌检测溶液中氟含量的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)配制LB液体培养基和LB固体培养基；
2)在LB固体培养基上划线接种过表达CsFEX型大肠杆菌并过夜培养；
3)挑取单克隆菌落，加入LB液体培养液并培养；
4)目的片段检测并测序，将其与从转录组PRJNA315669中筛选出的CsFEX基因比对，成功的菌液转接到液体LB中并培养；
5)配制含不同浓度氟的LB液体培养基；
6)将步骤4)中所得到的菌液转接到含不同浓度氟LB液体培养基中并培养；
7)紫外检测含不同浓度氟培养液中大肠杆菌生长的OD600值；
8)建立菌液生长OD值与氟含量的关系曲线和回归方程；所述回归方程的具体表达式是：y＝-0.0024x+1.5842；
9)称取步骤1)的LB液体培养基，向其中加入未知浓度的氟，得到含有未知浓度氟的LB液体培养基，将步骤4)中得到的菌液以1：100～1000的比例转接到含有未知浓度氟的LB液体培养基中并在恒温37℃、220rpm下振荡培养12h，得到培养后的菌液；
10)紫外检测步骤9)的培养后菌液中大肠杆菌生长的OD600值，根据步骤8)得到的回归方程，计算即可得到含有未知浓度氟的LB液体培养基中的氟浓度。


4.根据权利要求3所述的基于过表达CsFEX型大肠杆菌检测溶液中氟含量的方法，其特征在于：所述步骤1)中LB液体培养基的组分及含量是胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L；所述LB液体培养基的配制方式是：按比例称取LB液体培养基的各组分，120℃灭菌20min，待冷却至40～50℃后，以1：1000加入与转基因载体对应的抗生素，所述抗生素是卡那霉素；
所述LB固体培养基的组分及含量是胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L，所述LB固体培养基的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉花，武子辰，邢安琪，孙怡，徐晓寒，房婉萍，朱旭君，马媛春，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32