本发明专利技术公开了一种提高L‑组氨酸产生菌生产能力的方法，包括下述步骤：对于大肠杆菌来源的ATP磷酸核糖基转移酶进行突变，获得酶活力提高的突变体；设计编码该突变体的基因；将所述编码基因整合入大肠杆菌的基因组中，获得基因工程菌。本发明专利技术的方法能够将L‑组氨酸生产菌的L‑组氨酸生产能力提高3.5倍以上。
【技术实现步骤摘要】
一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法、一种L-组氨酸基因工程生产菌及其应用。
技术介绍
L-组氨酸(L-histidine)是一种半必需氨基酸，对于婴幼儿及动物的成长尤其重要，随年龄增长人体开始可以自己合成它，此外它也可作为生化试剂或医药中间体，用于生产药物。据行业研究报告显示，2017年，全球的组氨酸消耗大致为，食用559.5吨，药物1516.2吨，饲料393.1吨，预计到2023年L-组氨酸消费量将达到3000-4000吨，市场需求量越来越大。目前，L-组氨酸的制备主要有两种方法：国内主要是蛋白质水解方法制备(参见中国生化药物杂志,1982(02):12-17；CN101125831B)；国外主要通过谷氨酸棒杆菌或者大肠杆菌通过诱变获得高产L-组氨酸菌株通过微生物发酵方法制备(US8071339；CA02319283；CN1749390A；CN102286562A)。其中日本发酵公司协和和味之素的产量份额占90％以上。目前国内药用L-组氨酸主要通过进口，尚未实现微生物发酵法生产来自给。在大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径中，一个关键酶--ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)受到不同的中间代谢物和终产物抑制，尤其是终产物L-组氨酸的抑制。消除HisG的反馈抑制是组氨酸育种菌株中的重要步骤。先前报道的抗反馈抑制突变酶HisGE271K被嘌呤核苷酸(特别是ADP和AMP)通过与ATP底物的竞争性抑制而被抑制，同时研究发现5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(AICAR)也对ATP磷酸核糖基转移酶有极强的抑制(Malykhetal.,MicrobCellFact.(2018),17:42)。通过对谷氨酸棒状杆菌中的HisG进行多个氨基酸位点突变，最后获得了N215K/L231F/T235A突变体，该突变体Ki值提高了37倍，发酵液中产物浓度由0.11mM提高到4.15mM，进而实现了组氨酸的高产(Biochimie,94(2012),p829-838)。这些研究证明，通过基因工程手段获得更高产量的L-组氨酸生产菌株对于提高L-组氨酸生产的效益具有重要意义。
技术实现思路
为了构建L-组氨酸产量更高的基因工程菌株，本专利技术利用基因工程技术来改造产L--组氨酸的大肠杆菌。通过对组氨酸操纵子(hisoperon)进行改造，提高抗反馈抑制ATP磷酸核糖基转移酶的酶活力，获得L-组氨酸产量明显提高的菌株，从而提升了L-组氨酸的生产能力，具有广阔的工业化开发和应用前景。具体而言，本专利技术包括如下技术方案：一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：A.对大肠杆菌来源的ATP磷酸核糖基转移酶进行突变，获得酶活力提高的突变体；B.设计编码步骤A中所得ATP磷酸核糖基转移酶突变体的基因；C.将步骤B中所述基因整合入大肠杆菌的基因组中、或者替换大肠杆菌基因组中原始的ATP磷酸核糖基转移酶编码基因，获得基因工程菌。在一种实施方式中，步骤A中所述的大肠杆菌是大肠杆菌W3110。大肠杆菌W3110来源的ATP磷酸核糖基转移酶的氨基酸序列为SEQIDNO:18。优选地，上述突变体可以是SEQIDNO:18的K136E、S226Ter突变体(其中Ter为终止子)，其氨基酸序列为SEQIDNO:20。上述ATP磷酸核糖基转移酶突变体的编码基因可以是SEQIDNO:21。上述大肠杆菌W3110来源的ATP磷酸核糖基转移酶编码基因是SEQIDNO:19。对于原始的ATP磷酸核糖基转移酶编码基因例如SEQIDNO:19的替换可以是：先敲除或失活大肠杆菌中的该原始基因，然后整合入ATP磷酸核糖基转移酶突变体的编码基因比如SEQIDNO:21。在一种实施方式中，步骤C通过基因编辑技术实现。可选地，在另一种实施方式中，步骤C也可以通过下述步骤实现：构建表达ATP磷酸核糖基转移酶突变体的质粒例如载体pTrc99a，将质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，筛选得到基因测序验证正确的阳性克隆。上述基因编辑技术可以采用CRISPR-Cas系统例如CRISPR/Cas9系统、CRISPR-Cas相关的转座系统INTEGRATE系统、或者CAST系统。根据本专利技术的第二个方面，提供了一种基因工程菌，其按照上述的方法构建得到。根据本专利技术的第三个方面，提供了上述基因工程菌在生产L-组氨酸中的应用。优选通过上述基因工程菌的发酵来生产L-组氨酸。当上述基因工程菌发酵时，种子液培养基组成可以为：20g/L葡萄糖，4g/L酵母提取物，3g/L蛋白胨，1.2g/L磷酸二氢钾，0.5g/L硫酸镁·7H2O，10mg/L硫酸亚铁7H2O，10mg/L一水合硫酸锰，1mg/LVB1，1mg/LVB3，1mg/LVB5，1mg/LVB12，1mg/LVH，氢氧化钠调节至pH7.0-7.2。摇瓶发酵培养基组成可以为：20g/L葡萄糖，4g/L酵母提取物，3g/L蛋白胨，2g/L一水合柠檬酸钠，2g/L磷酸二氢钾，2g/L硫酸镁·7H2O，20mg/L硫酸亚铁，20mg/L硫酸锰，2mg/LVB1，2mg/LVB3，2mg/LVB5，2mg/LVB12，和2mg/LVH，氢氧化钠调节pH7.0-7.2之间，发酵每隔4h补加氨水至pH7.2-7.4。本专利技术的方法能够将L-组氨酸生产菌尤其是大肠杆菌的L-组氨酸生产能力提高至少3.6倍，具有工业化开发价值。附图说明图1为质粒pTrc99a的结构示意图，该质粒由中国科学院植物分子卓越中心杨晟研究员馈赠。图2为本专利技术构建的质粒pTrc99a-EchisG的结构示意图。具体实施方式本专利技术通过高通量筛选的方法，对大肠杆菌内源的野生型ATP磷酸核糖基转移酶进行定向诱变，经过酶活测定，获得抗反馈抑制的高活性ATP磷酸核糖基转移酶突变体，进而通过突变基因回补到野生型ATP磷酸核糖基转移酶突基因敲除大肠杆菌菌株中，然后进行发酵测试，得到L-组氨酸产量提高的基因工程生产菌。本文中的术语“L-组氨酸基因工程生产菌”、“L-组氨酸生产菌”、“基因工程菌”、“L-组氨酸基因工程生产菌”表示相同的意义。本专利技术的L-组氨酸生产菌的出发菌株或称原始菌株、野生型(WT)菌株是大肠杆菌W3110，有时简写为W3110。其内源的ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)即SEQIDNO:18简称为野生型hisG，其表达基因是SEQIDNO:19。在本文中，为了描述简便起见，有时会将某种蛋白比如ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于hisG，用于描述ATP磷酸核糖基转移酶功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该ATP磷酸核糖基转移酶的基因。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：/nA.对于大肠杆菌来源的ATP磷酸核糖基转移酶进行突变，获得酶活力提高的突变体；/nB.设计编码步骤A中所得ATP磷酸核糖基转移酶突变体的基因；/nC.将步骤B中所述基因整合入大肠杆菌的基因组中、或者替换大肠杆菌基因组中原始的ATP磷酸核糖基转移酶编码基因，获得基因工程菌。/n
【技术特征摘要】
1.一种提高L-组氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：
A.对于大肠杆菌来源的ATP磷酸核糖基转移酶进行突变，获得酶活力提高的突变体；
B.设计编码步骤A中所得ATP磷酸核糖基转移酶突变体的基因；
C.将步骤B中所述基因整合入大肠杆菌的基因组中、或者替换大肠杆菌基因组中原始的ATP磷酸核糖基转移酶编码基因，获得基因工程菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述大肠杆菌是大肠杆菌W3110。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述ATP磷酸核糖基转移酶的氨基酸序列为SEQIDNO:18。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述突变体是SEQIDNO:18的K136E、S226Ter突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO:20，其中Ter为终止子。
5.如权利要求4所述的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：范文超，刘映淼，王金刚，高书良，梁岩，任亮，
申请(专利权)人：浙江华睿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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