一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种高效生产1,3‑丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明专利技术在肺炎克雷伯氏菌中强化表达1,3‑丙二醇氧化还原酶来增强1,3‑丙二醇氧化还原酶的酶活，同时构建NADH再生途径，以降低3‑羟基丙醛的积累，强化3‑羟基丙醛转化为1,3‑丙二醇，从而提高1,3‑丙二醇的产量。本发明专利技术构建得到的基因工程菌1,3‑丙二醇氧化还原酶的酶活是出发菌株的3.25‑3.5倍；甲酸脱氢酶的酶活为0.414‑0.45U/mg。采用本发明专利技术构建得到的基因工程菌进行分批补料发酵29h，1,3‑丙二醇的产量比出发菌株提高了43.89％‑97.93％，双基因协同作用，显著提高了1,3‑丙二醇的产量和产率。

【技术实现步骤摘要】
一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PD)是一种重要的化工原料，除了能够作溶剂外，其主要作用是作为合成聚酯、聚氨酯的单体，以1,3-丙二醇和对苯二甲酸为单体合成的聚合物聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)是一种新型聚酯材料，具有易染色、弹性好、抗静电、可降解、良好的柔软性等特点，近年来也受到了人们的关注。1,3-丙二醇的生产方法有化学法和微生物发酵法两种。随着化石燃料资源的日益枯竭，基于石油资源的化学合成法受到严重限制，微生物发酵法生产1,3-丙二醇已经成为当前的研究热点。3-羟基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde，3-HPA)是甘油代谢生产1,3-丙二醇的重要中间产物。在甘油转化生产1,3-丙二醇的途径中，甘油在甘油脱水酶(GNlyceroldehydratase,GDHt)的催化下脱水生成了3-HPA，3-HPA在消耗还原力NADH(还原型辅酶I)的基础上，在1,3-丙二醇氧化还原酶(l,3-propanedioldehydroenase，PDOR)的催化下生成了1,3-丙二醇。而在利用肺炎克雷伯氏菌发酵法生产1,3-丙二醇的过程中，3-HPA的高浓度积累会对细胞的生长和代谢产物的合成产生严重的抑制作用，造成发酵过程非正常终止。3-HPA的积累是由于3-HPA的产生和消耗速率不平衡造成的，发酵前期甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活不平衡也是造成3-HPA积累的关键因素，而还原力NADH的消耗和供应不足也会影响发酵途径的正常进行和1,3-丙二醇的生产。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法与应用。本专利技术在肺炎克雷伯氏菌中强化表达1,3-丙二醇氧化还原酶来增强1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活，同时构建NADH再生途径，以降低3-羟基丙醛的积累，强化3-羟基丙醛转化为1,3-丙二醇，从而提高1,3-丙二醇的产量。本专利技术的技术方案如下：一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌，所述基因工程菌同时强化表达1,3-丙二醇氧化还原酶和甲酸脱氢酶。根据本专利技术优选的，所述基因工程菌为重组的肺炎克雷伯氏菌。根据本专利技术优选的，所述1,3-丙二醇氧化还原酶为来自肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化还原酶，其编码基因为Dhat，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；或者来自大肠杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶，其编码基因为YqhD，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。根据本专利技术优选的，所述甲酸脱氢酶为来自奥奈达希瓦式菌MR-1的甲酸脱氢酶，其编码基因为FdhD，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。根据本专利技术优选的，所述基因工程菌构建所用的表达载体中1,3-丙二醇氧化还原酶基因位于甲酸脱氢酶基因的上游，1,3-丙二醇氧化还原酶基因的表达采用1,3-丙二醇氧化还原酶基因启动子。根据本专利技术优选的，所述1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活是出发菌株的3.25-3.5倍，所述甲酸脱氢酶的酶活为0.414-0.45U/mg。采用本专利技术的基因工程菌进行分批补料发酵29h，1,3-丙二醇的产量比出发菌株提高了43.89％-97.93％。上述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)将载体质粒pET28a上的T7启动子替换为肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶启动子dhat，构建表达载体pET28a-dhat；(2)将肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化还原酶基因Dhat，或者大肠杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD插入pET28a-dhat，构建表达载体pET28a-dhat-Dhat或pET28a-dhat-YqhD；(3)将奥奈达希瓦式菌MR-1的甲酸脱氢酶基因FdhD插入pET28a-dhat-Dhat或pET28a-dhat-YqhD，构建表达载体pET28a-dhat-Dhat-FdhD或pET28a-dhat-YqhD-FdhD；(4)将表达载体pET28a-dhat-Dhat-FdhD或pET28a-dhat-YqhD-FdhD转化进肺炎克雷伯氏菌，挑选阳性重组子，得基因工程菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD或K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD。根据本专利技术优选的，所述基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：(1)以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶启动子dhat序列，PCR引物序列如下：Primer1:5′-CGAGCTCATGAGCTATCGTATGTTTGA-3′(含BglII酶切位点)，Primer2:5′-CCCAAGCTTTCAGAATGCCTGGCGGAA-3′(含SacI酶切位点)；PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃30sec；延伸，72℃30sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；将载体质粒pET28a和PCR扩增产物分别用BglII和SacI双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat质粒；(2)以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶基因Dhat序列，PCR引物序列如下：Primer3:5′-CGCGGATCCGAATTCGAGCTCATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTGG-3′(含SacI酶切位点)，Primer4:5′-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCAGAATGCCTGGCGGAA-3′(含HindIII酶切位点)；PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，68℃30sec；延伸，72℃90sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；将PCR扩增产物和步骤(1)得到的载体质粒pET28a-dhat分别用SacI和HindIII双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat-Dhat质粒；或者，以大肠杆菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD序列，PCR引物序列如下：Primer5:5′-CGCGGATCCGAATTCGAGCTCATGAACAACTTTAATCTGCACACCC-3′(含SacI酶切位点)，Primer6:5′-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGCGGGCGGCTTCGTA-3′(含HindIII酶切位点)；PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，70℃30sec；延伸，72℃90sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌同时强化表达1,3-丙二醇氧化还原酶和甲酸脱氢酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效生产1,3-丙二醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌同时强化表达1,3-丙二醇氧化还原酶和甲酸脱氢酶。


2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为重组的肺炎克雷伯氏菌。


3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述1,3-丙二醇氧化还原酶为来自肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化还原酶，其编码基因为Dhat，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；或者来自大肠杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶，其编码基因为YqhD，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述甲酸脱氢酶为来自奥奈达希瓦式菌MR-1的甲酸脱氢酶，其编码基因为FdhD，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


5.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌构建所用的表达载体中1,3-丙二醇氧化还原酶基因位于甲酸脱氢酶基因的上游，1,3-丙二醇氧化还原酶基因的表达采用1,3-丙二醇氧化还原酶基因启动子。


6.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活是出发菌株的3.25-3.5倍，所述甲酸脱氢酶的酶活为0.414-0.45U/mg。


7.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将载体质粒pET28a上的T7启动子替换为肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶启动子dhat，构建表达载体pET28a-dhat；
(2)将肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化还原酶基因Dhat，或者大肠杆菌的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因YqhD插入pET28a-dhat，构建表达载体pET28a-dhat-Dhat或pET28a-dhat-YqhD；
(3)将奥奈达希瓦式菌MR-1的甲酸脱氢酶基因FdhD插入pET28a-dhat-Dhat或pET28a-dhat-YqhD，构建表达载体pET28a-dhat-Dhat-FdhD或pET28a-dhat-YqhD-FdhD；
(4)将表达载体pET28a-dhat-Dhat-FdhD或pET28a-dhat-YqhD-FdhD转化进肺炎克雷伯氏菌，挑选阳性重组子，得基因工程菌K.pneumoniae/pET28a-dhat-Dhat-FdhD或K.pneumoniae/pET28a-dhat-YqhD-FdhD。


8.如权利要求7所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶启动子dhat序列，PCR引物序列如下：
Primer1:5′-CGAGCTCATGAGCTATCGTATGTTTGA-3′(含BglII酶切位点)，
Primer2:5′-CCCAAGCTTTCAGAATGCCTGGCGGAA-3′(含SacI酶切位点)；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，60℃30sec；延伸，72℃30sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温；
将载体质粒pET28a和PCR扩增产物分别用BglII和SacI双酶切后，经连接酶连接得到pET28a-dhat质粒；
(2)以肺炎克雷伯氏菌基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到1,3-丙二醇氧化还原酶基因Dhat序列，PCR引物序列如下：
Primer3:5′-CGCGGATCCGAATTCGAGCTCATGAGCTATCGTATGTTTGATTATCTGG-3′(含SacI酶切位点)，
Primer4:5′-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCAGAATGCCTGGCGGAA-3′(含HindIII酶切位点)；
PCR扩增程序：预变性，95℃5min；变性，95℃30sec；退火，68℃30sec；延伸，72℃90sec(30个循环)；终止延伸，72℃10min；最后4℃保温...

【专利技术属性】
技术研发人员：马春玲，王瑞明，李丕武，王艳霞，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37