一种通过原生质体高效富集植物线粒体的方法技术

一种通过原生质体，高效富集植物线粒体的方法，该方法的技术核心在于原生质体的获得和滤膜的过滤，主要针对植物叶肉细胞及其他可以游离原生质体的组织成分，高效分离纯化线粒体，其步骤为：1)植物材料的培养；2)游离原生质体；3)利用渗透压自然胀裂原生质体；4)差速离心，获得粗线粒体；5)利用PES材质针头过滤器过滤粗线粒体的重悬缓冲液，得到纯净的线粒体；6)荧光显微镜检测线粒体纯度。本发明专利技术操作便捷、耗时略长，但效果稳定，可高效地富集到线粒体，对探究植物线粒体功能具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种通过原生质体高效富集植物线粒体的方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种通过原生质体高效富集植物线粒体的方法。
技术介绍
线粒体和叶绿体是细胞活动的能量中心，叶绿体通过光合作用给生物有机体供能，线粒体通过氧化磷酸化将有机物储存的能量转换为细胞生命活动的直接能源ATP。线粒体和叶绿体都具有半自主遗传的特性，与细胞核一起构成了植物的遗传库。在植物有机体中线粒体和叶绿体是相辅相成，密不可分的细胞器组分。然而，为了研究植物线粒体的结构和功能，叶绿体的存在也为线粒体的研究设置了障碍。以往的研究中，为了避免叶绿体等质体的干扰，多选取黄化苗、植物的根、悬浮细胞或愈伤组织为试验材料，尽量减少叶绿体的干扰。利用线粒体和叶绿体密度不同的特征，采用蔗糖或percoll梯度密度离心的方式进一步分离纯化线粒体。然而，这样的提取过程过于繁琐，还需要超高速离心，不利于线粒体的快速获取。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种通过原生质体高效富集植物线粒体的方法，基于原生质体渗透破裂、低温差速离心和针头注射器滤膜技术，利用PES材质针头过滤器，高效滤除粗线粒体沉淀中的叶绿体碎片，可以快速、高效、便捷地从原生质体富集纯化线粒体，以备后续试验。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种通过原生质体高效富集植物线粒体的方法，包括如下步骤：步骤1)，培养植物材料，配制游离原生质体裂解缓冲液，游离植物组织的完整原生质体；步骤2)，利用渗透压，自然胀裂原生质体；步骤3)，利用差速离心，获得粗线粒体；步骤4)，利用PES材质针头过滤器过滤粗线粒体的重悬缓冲液，得到纯净的线粒体。所述步骤1)中，避光条件下，撕植物叶片的下表皮，暴露的叶肉细胞平铺在游离原生质体裂解缓冲液表面，低温离心获得完整的原生质体。所述植物材料为烟草，尤其是单标转基因AtDIPS-GFP烟草，取烟草成熟饱满的种子，点在穴盘中，经光照16h，暗8h培养，4周后，将小苗移栽到2000mL的花盆中，按质量比，培养土的成分为营养土：草炭土：蛭石＝1：1：1，23+1℃，4周后，收集其叶片，现摘现用，清洗后，吸水纸吸水，平铺在报纸上约1-2h，待叶片部分失水后，尽快撕掉叶片下表皮，叶肉细胞暴露的一面与游离原生质体缓冲液，充分接触，平铺在液面上，避光40min，缓慢摇晃，将溶液4层纱布过滤后，烧杯中混匀，分装到250mL离心管中，水平转子100g离心，5min，抽除上清，沉淀即为原生质体。所述游离原生质体裂解缓冲液的成分为：600mMD-mannitol、0.5％Potassiumdexransulphate、1％CellulaseR10、0.1％PectlyaseY23，pH＝5.4，混合均匀，4℃放置待用。所述步骤2)中，配制TANBuffer，用毛笔轻轻重悬原生质体沉淀，静置10min，TANBuffer的主要成分为：20mMTris-HCl，0.5mMEDTA，1.2mMSpermidine，0.4mMPMSF，0.1％β-ME，0.2％BSA，17％Sucrose，pH＝7.5-8.0，其中Spermidine，PMSF，β-ME，BSA现用现加。所述步骤3)中，利用差速离心，除去细胞碎片、细胞核和叶绿体的干扰，差速离心参数依次为：1700g、5min；1700g、10min；14500g、30min。所述步骤4)中，在粗线粒体中加入2mL线粒体悬浮液，经5μm和3μm注射器滤膜依次过滤。所述重悬缓冲液的成分为：350mMSorbitol、5mMEDTA、50mMTris-HCl，pH＝8.0，混合后0.22μm滤膜过滤，4℃放置待用。本专利技术中，所有的操作维持4℃低温。在获得纯净的线粒体后，利用流式细胞分选仪测定线粒体纯度和均一性，利用荧光显微检测观察所得到的线粒体：GFP观察线粒体，RFP观察叶绿体。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、该方法适合较易获得原生质体的植物组织。2、通过游离完整的原生质体，根据渗透原理，原生质体自然胀裂，经过低温差速离心，除去细胞碎片和叶绿体干扰，获得粗线粒体沉淀，经滤膜过滤即可得到纯净的线粒体。该方法简单、快捷、针对以获取原生质体的组织很有效，是有效获得高纯度线粒体的技术之一，可为植物线粒体研究提供技术支持。3、本专利技术的所用PES材质针头过滤器可以有效去除叶绿体碎片的干扰，获得的线粒体溶液颜色为淡黄色或无色。4、该方法不需要梯度密度离心，不需要超高速离心机，普通高速离心机就可达到需求，具有简单、便捷的有点。5、本专利技术获得的线粒体均匀分布在溶液种，有效排除叶绿体的干扰，比研磨法获得的线粒体纯度更高，有效排除叶绿体碎片的干扰，可为植物线粒体的提取和纯化提供新的方案。附图说明图1为本专利技术流程图。图2为基于本专利技术利用荧光显微镜观察的线粒体提取的结果。图3为流式细胞仪检测提取的线粒体质量。具体实施方式下面结合附图和实施例详细说明本专利技术的实施方式。如图1所示，本专利技术通过原生质体高效富集植物线粒体的方法，在获得纯净的线粒体后，结合差速离心利用无机氧化铝滤膜，针对植物叶肉细胞(或其他易获取原生质体的植物组织，其他可提取原生质体的植物组织可参考此流程)，分离纯化线粒体，其主要步骤为：1)植物材料的培养：以烟草(Nicotianatabacum)的叶片为例，取AtDIPS-GFP单标转基因的烟草成熟饱满的种子培养在穴盘中，以质量计，培养土的成分为营养土：压缩土：蛭石＝1：1：1，温度23+1℃，16h光照，8h暗培养，约4周后，将小苗移栽到2000mL的花盆中，注意及时补充水分，约4周后，收集其叶片，现摘现用。植物材料的生长状态是植物线粒体提取成败的重要因素。2)缓冲液的配制，以质量百分比计：①游离原生质体裂解缓冲液：600mMD-mannitol、0.5％Potassiumdexransulphate、1％CellulaseR10、0.1％PectlyaseY23，pH＝5.4。混合均匀，4℃放置待用；②TANBuffer的主要成分为：20mMTris-HCl，0.5mMEDTA，1.2mMSpermidine，0.4mMPMSF，0.1％β-ME，0.2％BSA，17％Sucrose(pH＝7.5-8.0)。注：Spermidine，PMSF，β-ME，BSA现用现加，具有抗氧化，保护巯基，抑制多酚氧化酶的作用。③线粒体重悬缓冲液：350mMSorbitol、5mMEDTA、50mMTris-HCl(pH＝8.0)混合后0.22μm滤膜过滤，4℃放置待用。3)游离原生质体：所有操作未标注都在4℃进行。收集培养的烟草叶片清洗后，吸水纸吸水，平铺在报纸上约1-2h，待叶片部分失水后，尽快撕掉叶片下表皮。叶肉细胞暴露的一面与游离原生质体缓冲液充分接触，平铺在液面上，避本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过原生质体高效富集植物线粒体的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤1)，培养植物材料，配制游离原生质体裂解缓冲液，游离植物组织的完整原生质体；/n步骤2)，利用渗透压，自然胀裂原生质体；/n步骤3)，利用差速离心，获得粗线粒体；/n步骤4)，利用PES材质针头过滤器过滤粗线粒体的重悬缓冲液，得到纯净的线粒体。/n

【技术特征摘要】
1.一种通过原生质体高效富集植物线粒体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)，培养植物材料，配制游离原生质体裂解缓冲液，游离植物组织的完整原生质体；
步骤2)，利用渗透压，自然胀裂原生质体；
步骤3)，利用差速离心，获得粗线粒体；
步骤4)，利用PES材质针头过滤器过滤粗线粒体的重悬缓冲液，得到纯净的线粒体。


2.根据权利要求1所述通过原生质体高效富集植物线粒体的方法，其特征在于，所述步骤1)中，避光条件下，撕植物叶片的下表皮，暴露的叶肉细胞平铺在游离原生质体裂解缓冲液表面，低温离心获得完整的原生质体。


3.根据权利要求1所述通过原生质体高效富集植物线粒体的方法，其特征在于，所述植物材料为烟草，尤其是单标转基因AtDIPS-GFP烟草，取烟草成熟饱满的种子，点在穴盘中，经光照16h，暗8h培养，4周后，将小苗移栽到2000mL的花盆中，按质量比，培养土的成分为营养土：草炭土：蛭石＝1：1：1，23+1℃，4周后，收集其叶片，现摘现用，清洗后，吸水纸吸水，平铺在报纸上约1-2h，待叶片部分失水后，尽快撕掉叶片下表皮，叶肉细胞暴露的一面与游离原生质体缓冲液，充分接触，平铺在液面上，避光40min，缓慢摇晃，将溶液4层纱布过滤后，烧杯中混匀，分装到250mL离心管中，水平转子100g离心，5min，抽除上清，沉淀即为原生质体。


4.根据权利要求1或2或3所述通过原生质体高效富集植物线粒体的方法，其特征在于，所述游离原生质体裂解缓冲液的成分为：600mMD-mannitol、0.5％Potassiumdexransulphate、1％CellulaseR10、0.1％PectlyaseY23，pH＝5.4...

【专利技术属性】
技术研发人员：于婷乔，段光兴，袁英，张泉，苏都莫日根，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11