本发明专利技术提供了一种定量检测促甲状腺素（ＴＳＨ）化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。本发明专利技术的优点在于：采用“双抗夹心法”的反应模式，有效地利用了化学发光技术结合异硫氰酸荧光素－抗异硫氰酸荧光素技术，并采用了辣根过氧化酶作为标记酶，定量检测人体血清样品中ＴＳＨ的含量，确保了检测的灵敏度，大大节省了原料。本发明专利技术的试剂盒灵敏度高，重复性好，反应时间短，具有良好的稳定性，试剂效期长，能及时为临床诊断、治疗甲状腺疾病提供实验依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫检测分析领域，具体涉及到一种促甲状腺素测定试剂盒及其 制备方法。本专利技术试剂盒结合了异硫氰酸荧光素(FITC)-抗异硫氰酸荧光素技 术和化学发光免疫分析技术。
技术介绍
促甲状腺素(TSH)是垂体前叶分泌的一种糖蛋白激素，其浓度受垂体分泌 的促甲状腺素释放激素以及血液中的甲状腺素T4和T3的影响。它可以调节甲 状腺细胞的功能，影响甲状腺激素合成，葡萄糖氧化以及蛋白合成。当甲状腺功 能发生改变时，TSH水平呈现明显的波动。测定血清中TSH的浓度是判断甲状腺 功能是否正常的首选指标，也是研究下丘脑-垂体-甲状腺轴反馈调节机能等的重 要参数，临床上多用于甲状腺功能亢进(甲亢)和减退(甲减)的诊断、原发与 继发性甲减的鉴别诊断、监视甲亢和甲减的疗效、亚临床甲亢的诊断、新生儿甲 低的筛査以及垂体促甲状腺素瘤的实验室诊断等，是评价甲状腺功能一项敏感指 标。目前检测促甲状腺素的免疫学方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析 法、直接化学发光免疫分析法、电化学免疫分析和时间分辨荧光免疫分析法等。这些方法均具有不可避免的不足之处放射性元素对环境的污染及半衰期短等因素限制RIA与IRMA的广泛应用；酶免疫吸附分析法的灵敏度欠佳无法满足临床 要求；直接化学发光免疫分析因发光时间短，需要高精度自动分析系统；电化学 发光检测和时间分辨荧光检测法需要昂贵和复杂的仪器设备。因此建立便捷、高 灵敏检测TSH的方法具有重大的意义。化学发光免疫分析技术是把高灵敏的化学发光分析方法和特异性强的免疫 分析方法相结合发展起来的一项具有化学发光分析的高灵敏度和免疫分析法的 高选择性的新的免疫分析技术。该法具有特异性高、灵敏度高、快速、简便及无 放射性污染等优点，已受到广大医学、生物和化学工作者的关注。本专利技术就是采 用"双抗夹心"化学发光免疫分析技术测定人血清中的促甲状腺素，通过配对抗 体分别与特异抗原发生反应，形成夹心复合物，从而可以迅速的从血清中高度特异的识别相应的抗原。单纯利用物理吸附把单克隆抗体包被到固相载体上(聚苯 乙烯板)会存在抗体用量大，活性损失大等缺点，而采用FITC-抗FITC系统可 以避免这样的缺点。本专利技术就是利用FITC-抗FITC的反应体系，将FITC单克隆 抗体包被到固相载体上，然后加入FITC标记的TSH单克隆抗体即把抗体负载到 固相载体，向其中加入血清样品和标准，再加入酶标记物，与血清中的蛋白分子 夹心形成特异性的结合，然后加入化学发光底物，利用化学发光仪检测相对发光 强度，就可以定量分析人血清中的促甲状腺素。异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)具有很强的免疫原 性，很容易产生与半抗原结合的特异性抗体，用FITC标记的蛋白方法简便，一 般不破坏标记物的生物活性，单位蛋白上可实现多个标记。该技术的新颖之处有: (l)异硫氰酸荧光素单克隆抗体容易制备，且使用单克隆抗体，可以提高反应的 特异性；(2)异硫氰酸荧光素抗体的标记简单易行，对蛋白活性影响小；(3)异硫 氰酸荧光素单克隆抗体的包被可以大大节省抗体的用量，降低了成本。化学发光免疫分析结合FITC-抗FITC系统体系是一种检测TSH的先进而有 效的方法，无需昂贵的仪器，还可以大大节省原料，并且操作简便、适用性广， 既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，有助 于促进化学发光免疫分析技术在临床检验、检测中的应用与发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种FITC-抗FITC技术结合化学发光免疫分析定量测 定促甲状腺素的化学发光免疫分析测定试剂盒。根据本专利技术的试剂盒包括TSH校准品、FITC抗体包被的聚苯乙烯微孔板、 FITC标记的TSH单克隆抗体、辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体、上述酶所作 用的化学发光底物液、以及IO倍浓縮洗涤液。本专利技术的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。根据本专利技术制备上述试剂盒的方法包括以下步骤1) 以TSH纯品配制校准品；2) 以FITC抗体包被聚苯乙烯微孔板；3) FITC标记TSH单克隆抗体；4) 以辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体；5) 配制辣根过氧化酶所作用的化学发光底物液；6) 配制10倍浓縮洗涤液；以及7) 分装上述组分并组装为成品。根据本专利技术的方法，在所述包被FITC抗体的聚苯乙烯微孔板步骤2)中，具体地包被方法包括所述的包被方法采用0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液(包含4.44g的 柠檬酸和7.3g的柠檬酸三钠去离子水溶液制成缓冲液)，与适当浓度的FITC 单克隆抗体混合制成包被液，负载于固相载体上；然后用PBST洗涤液洗 涤两次；用封闭液(包含O.IM三羟甲基氨基甲垸、150mM氯化钠、1%BSA 和0.1%生物防腐剂，pH值为7.4 7.6)封闭上述洗涤后的固相载体，干燥 封板后保存备用。根据本专利技术的方法，在所述以辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体的步骤4) 中，采用改良的过碘酸钠法以辣根过氧化酶标记TSH单克隆抗体。根据本专利技术的方法，所述化学发光底物液为鲁米诺-过氧化氢混合液，包 含A液和B液，其中所述化学发光底物A液，包括10mM鲁米诺、0. 3mM 4-羟基联苯、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8.0 10. 0;所述化学发光底物B液，包括3. 5mM过氧化脲、0. 1% Tween20、 0. 2M pH7. 2 磷酸盐缓冲液，其pH值为7.0 7.6;使用时将A液与B液按1: 1比例混合。所述10倍浓縮洗涤液包含0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液、8% NaCl、 0.1% Tween-20、 0.1% Proclin 300，调整pH至7. 2 7. 4，使用时用蒸馏水稀释10 倍。本专利技术"促甲状腺素化学发光免疫分析测定试剂盒"可以简便快捷、高灵敏、 高重现性地检测出人血清中促甲状腺素的含量，可以根据促甲状腺素含量的多少 判断病情及治疗效果。本专利技术的试剂盒提供了一种简便快速、高灵敏、高特异定 量检测TSH的测定试剂盒。本专利技术采用"双抗夹心法"的反应模式，有效地利用了化学发光技术结合 FITC-抗FITC包被技术原理，定量检测人体血清、血浆样品中TSH的含量，确保 了检测的灵敏度。本专利技术的试剂盒结构简单，使用方便，价格便宜，携带便利， 与市场上的酶联免疫试剂盒相比，线性表现均很好，并且临床符合率也大大提高，可为人体甲状腺功能亢进(甲亢)和减退(甲减)的诊断、原发与继发性甲减的 鉴别诊断、监视甲亢和甲减的疗效、亚临床甲亢的诊断、新生儿甲低的筛査以及 垂体促甲状腺素瘤的实验室诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。附图说明图1为实施例1所制备的试剂盒的校准曲线图(log-log标准曲线)。 图2为本专利技术的试剂盒同ELISA试剂盒临床血样测值比对的相关曲线。具体实施例方式实施例l制备本专利技术的TSH化学发光免疫分析测定试剂盒一、 TSH校准品的制备用去激素人血清将TSH纯品稀释成校准品，分装0、 0.1、 0.5、 2.5、 10、 40 uIU/mL共6瓶。二、 抗FITC抗体包被微孔板的制备1) 包被采用1000mL的0.046MpH值为4.6的柠檬酸缓冲液(包含4.44g的柠本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促甲状腺素（ＴＳＨ）化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：ＴＳＨ校准品、异硫氰酸荧光素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）抗体包被的聚苯乙烯微孔板、ＦＩＴＣ标记的ＴＳＨ单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的ＴＳＨ单克隆抗体、上述辣根过氧化酶所作用的化学发光底物液、以及１０倍浓缩洗涤液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：辛天兵，应希堂，宋胜利，胡国茂，唐宝军，于尚永，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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