本发明专利技术提供了一种甲状腺过氧化酶自身抗体（ＴＰＯＡｂ）的化学发光免疫测定试剂盒及制备方法。本发明专利技术的优点在于：采用“双抗原夹心法”的反应模式，有效地利用了化学发光技术和生物素－亲和素免疫放大技术原理，并采用了辣根过氧化酶作为标记酶，定量检测人体血清样品中甲状腺过氧化酶自身抗体的含量，确保了检测的灵敏度。本发明专利技术的试剂盒具有灵敏度高，重复性好，稳定性好，检测效率高，可为临床诊断、治疗甲状腺疾病提供及时、可靠的实验依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫分析领域，具体涉及到一种甲状腺过氧化物酶自身抗体测定 试剂盒及其制备方法。本专利技术试剂盒结合了生物素-亲和素免疫放大技术和化学 发光免疫分析技术。
技术介绍
人体甲状腺是内分泌系统中重要的组成部分，甲状腺激素参与许多重要的生 理反应。它们在人体生长发育、细胞代谢和体内激素平衡，以及对维持代谢、骨 骼肌和各器官系统的发育都起着重要的调节作用。自身免疫性甲状腺疾病(AITD) 是由T细胞所介导的器官特异自身免疫性疾病，患者血清中存在多种针对甲状腺 抗原的自身抗体，甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody, TP0Ab) 是其中最重要的一种，普遍存在于自身免疫性甲状腺疾病中。近年来研究证实， TPO是一种膜整合蛋白，其分子量为110KD， TPO在滤泡细胞中由甲状腺激素合 成，是甲状腺微粒体(TM)的主要抗原成分，存在于患者体内的TPOAb就是甲状腺 微粒体抗体(TMAb)。 一般认为，对于AITD的诊断，测定血清TPOAb比测定TMAb 更可靠。TP0Ab还是AITD患者体内一种重要的免疫学指标，而且对甲状腺疾病 的诊断有较好的特异性。对原发性甲减患者，结合hTSH升高，可以发现早期甲 减病人。TP0Ab的测定还可作为Graves病、桥本甲亢等诊断和鉴别诊断的首选 指标。目前，免疫分析方法可以提供分析物的宽范围检测和很低的检测限，并且费 用低廉，为分析物的检测提供了一个快速、简便、高灵敏度的分析方法。因此， 免疫分析法作为一种重要的分析方法已广泛应用于临床诊断和生物化学等方面 的研究。常用TPOAb检测的方法有放射免疫分析法(radioimmunoassay， RIA)、酶 免疫分析法(enzyme linked immunosorbentassay， ELISA)和化学发光免疫分析法 (chemiluminescence immunoassay, CLIA)等。然而，放射性元素对环境的污染及 半衰期短等因素限制RIA与IRMA的广泛应用；酶免疫吸附分析法因灵敏度低、 检测范围窄等无法满足临床要求。化学发光免疫分析技术是把高灵敏的化学发光分析方法和特异性强的免疫分析方法相结合发展起来的一项具有化学发光分析 的高灵敏度和免疫分析法的高选择性的新的免疫分析技术。该法具有特异性高、 灵敏度高、快速、简便及无放射性污染等优点，已广泛应用于医学、生物和化学 等领域。生物素-亲和素(biotin-avidin system, BAS)之间的亲和常数远大于抗原 -抗体间亲和常数，且每个亲和素能结合4个分子的生物素。它们之间一旦发生 结合，则很难分离，且受pH、有机溶剂的影响很小。生物素的分子量小，生物 素的蛋白标记过程简单，对蛋白活性影响小，单位蛋白上可实现多个生物素标记。 该系统具有多级的信号放大作用，并且不增加非特异性千扰，且具有灵敏度高、 特异性好、稳定性高、适用性强和实验成本低等特点。待测反应体系可以利用生 物素化的抗原，使得亲和素-生物素系统与免疫分析检测体系偶联，放大终反应。本专利技术采用"双抗原夹心法"的化学发光免疫分析技术测定人血清中的甲状 腺过氧化物酶自身抗体，两个特异抗原分别针对抗体形成夹心复合物。如果单纯 利用直接化学发光免疫分析的方法，则方法的灵敏度比较低，而采用生物素-亲 和素系统就可以避免这样的缺点。本专利技术就是利用链亲和素标记的酶与生物素化 的甲状腺过氧化物酶抗原结合，当血清样品和标准加入固相载体后，包被好的抗 原与血清中的TPO抗体形成特异性的夹心复合物，然后加入化学发光底物，利用 化学发光仪检测相对发光强度，就可以定量分析人血清中的甲状腺过氧化物酶自 身抗体。化学发光免疫分析结合生物素-亲和素系统体系是一种检测TP0Ab的先进而 有效的方法，无需昂贵的仪器，还可以大大提高灵敏度，并且操作简便、适用性 广，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统， 更加有助于促进化学发光免疫分析技术在临床检验、检测中的应用与发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生物素一亲和素免疫放大技术和化学发光免疫分 析技术相结合定量检测人血清中甲状腺过氧化物酶自身抗体的化学发光免疫分 析测定试剂盒。根据本专利技术的试剂盒包括甲状腺过氧化物酶自身抗体校准品、甲状腺过氧 化酶包被的微孔板、生物素化的甲状腺过氧化物酶抗原、辣根过氧化酶标记的链 亲和素、上述辣根过氧化酶所作用的化学发光底物液以及25倍浓縮洗涤液。本专利技术的再一 目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。根据本专利技术制备上述试剂盒的方法包括以下步骤a) 以甲状腺过氧化物酶自身抗体配制校准品，用马血清将TPOAb纯品稀释成不同浓度的校准品。b) 甲状腺过氧化物酶抗原包被微孔板，具体地包被方法包括采用0.05 M pH 7.2的PBS缓冲液与适当浓度的甲状腺过氧化物酶抗原混合制成包被液， 并将其负载于微孔板上；用洗涤缓冲液洗漆后，再用水解明胶封闭液进行封闭2h;然后洗涤五次，干燥封袋后保存备用。c) 生物素化标记甲状腺过氧化物酶抗原，是通过生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与抗原发生偶联反应而实现的。d) 辣根过氧化酶标记链亲和素，是采用改良的戊二醛法以辣根过氧化酶标记链亲和素。e) 配制化学发光底物液包含A液和B液，其中所述化学发光底物A液， 包括lOmM鲁米诺、0. 3raM 4-羟基联苯、0. 05mM 4-碘苯硼酸、0. 2M pH8. 7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8.0 10.0;所述化学发光底物B液，包括3.5mM过氧 化脲、0. l%Tween20、 0. 2M pH7. 2磷酸盐缓冲液，其pH值为7. 0 7. 6。f) 配制25倍浓縮洗涤液包含0. 25M pH7. 4磷酸盐缓冲液、20% NaCl、 0. 1% Tween-20、 0. 1% Proclin 300，调整pH至7. 2 7. 4，使用时用蒸馏水稀释25 倍。g) 分装上述组分并组装为成品。具体的上述试剂盒采用"双抗原夹心法"的反应模式，有效地利用了化学发 光技术结合生物素-亲和素免疫放大技术原理，确保了检测的灵敏度。本专利技术试 剂盒对于自身免疫性甲状腺疾病、原发和继发性甲减、Graves病、桥本甲亢等 疾病的诊断提供了可靠的依据。本专利技术试剂盒灵敏度高，重复性好，具有良好的 稳定性和较高的检测效率。附图说明图1为实施例1所制备的试剂盒的校准曲线图(log-log标准曲线)。 具体实施例方式实施例1制备本专利技术的TP0Ab化学发光免疫分析测定试剂盒一、 TPOAb校准品的制备用马血清将TPOAb纯品稀释成校准品，浓度分别为0、 25、 50、 150、 300、 600 IU/mL。二、 TPO抗原包被微孔板的制备a) 包被采用0.05 MpH 7.2的PBS缓冲液与适当浓度的甲状腺过氧化物酶抗原混 合制成包被液，并将其负载于发光微孔板上；b) 用洗涤液洗涤上述微孔板；以及c) 封闭配制水解明胶封闭液，基于lOOOmL所述封闭液包含L28mM NaH2P04 2H20， 8.10mMNa2HP04 12H20， 1.0%水解明胶，0.1 %Proclin300， 其pH为7.2 7.4，然后将所得封闭液负载本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甲状腺过氧化物酶自身抗体（ＴＰＯＡｂ）化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：甲状腺过氧化物酶自身抗体校准品、甲状腺过氧化酶抗原包被的微孔板、生物素化的甲状腺过氧化物酶抗原、辣根过氧化酶标记的链亲和素、上述辣根酶所作用的化学发光底物液以及２５倍浓缩洗涤液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：辛天兵，应希堂，宋胜利，胡国茂，郑金来，于尚永，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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