一种检测甲状腺球蛋白抗体的化学发光免疫分析测定试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种应用于临床血液免疫检测分析领域的甲状腺球蛋白抗体的测定试剂盒及其制备方法。本发明专利技术试剂盒采用化学发光免疫分析技术和抗体间接法反应模式，其优点在于检测灵敏高、试剂稳定性好，操作时间短、步骤简单且对操作人员无放射性危害。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学临床血液免疫检测分析领域,具体的提供了 一种检测灵敏高、 试剂稳定性好，操作时间短、步骤简单且对操作人员无放射性危害的曱状腺球蛋 白抗体化学发光免疫测定试剂盒。
技术介绍
甲状腺球蛋白(Tg)是一种相对分子量为660KD的糖蛋白，其抗体(Anti-Tg) 是自身免疫性甲状腺疾病(AITD)的重要标志物，具有较高的诊断意义。Anti-Tg包括IgGl、 IgG2、 IgG3和gG4 4个亚目，以IgGl和IgG4占优势， 但IgG2功能活性最高。Anti-Tg与曱状腺球蛋白(Tg)结合后，通过FC受体与结合 抗体的相互作用激活NK细胞而攻击輩巴细胞，导致曱状腺细胞^s皮坏。Anti-Tg可以 影响Tg抗原的摄取、加工，因而可以增强或抑制非显性致病性T细胞抗原决定簇 的产生及递呈，进而影响AITD时的细胞免疫。Anti-Tg对致病性曱状腺球蛋白T 细胞抗原决定簇的识别可以呈现中性、抑制或增强效应，这主要取决于Anti-Tg 所识别的抗原决定簇有无个体遗传背景，在某些AITD患者，其净效应可能是加重 疾病以及对非显性T细胞抗原决定簇自身免疫反应的扩大，从而导致AITD的发生 及恶化。Anti-Tg与Tg结合位点上存在着酶的催化位点，因此，Anti-Tg有酶活 性，可以催化Tg水解，导致血及曱状腺中Tg减少。血中Tg的减少可以降低机体 免疫系统对Tg的暴露，因而对Tg的自身免疫反应减弱。另一方面，由于曱状腺 激素合成依赖曱状腺过氧化物酶(TPO)对天然Tg的识别，因此，Tg减少必然导致 T3 、 T4合成减少。值得注意的是，分泌Anti-Tg的B淋巴细胞主要存在于甲状腺 内，当甲状腺内Anti-Tg积累到一定浓度时，不仅Tg分解增加，也可导致其它与 Tg无关的蛋白发生水解，从而可能造成全身性的蛋白作用增强及组织损伤。由于传统的放射免疫分析方法具有对操作人员有放射性危害、废弃物处理问题、产品保质期短、操作时间长等问题，而酶联免疫分析法的灵敏度较低，存在 操作步骤繁瑣，操作时间周期长，易造成结果假阳性或假阴性等问题，从而需要 人们寻找一种更为安全、灵敏和可靠的免疫检测分析方法。本专利技术采用高活性的 辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，以双氧水、鲁米诺及增强剂为发光底物，其原 理是HA在HRP作用下氧化鲁米诺使其达到激发态，当其回到基态时发出 420-515nm的光，再通过发光分析仪来检测光信号。HRP酶促发光10分钟即可达 到发光高峰，可缩短操作时间，同时微孔板反应模式有利于进行样品的批量检测， 适合于我国的现有国情。
技术实现思路
本专利技术避免了放射免疫分析中放射性物质对操作人员的放射性危害，解决了 放射性废弃物的处理问题，使产品的保存期更长；与酶联免疫分析方法相比，操 作步骤更加简化，大大提高了分析方法的灵敏度，并节省了操作时间。因此本发 明提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测曱状腺球蛋白抗体的试剂盒， 并且使该试剂盒更适用于小中型医院的推广应用。首先，本专利技术提供了一种化学发光免疫分析测定曱状腺球蛋白的试剂盒。 根据本专利技术的试剂盒包括曱状腺球蛋白抗体校准品；曱状腺球蛋白包被的 固相载体；辣根过氧化物酶标记的抗人IgG;化学发光底物液；以及浓缩洗涤液。 根据本专利技术的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管。 根据本专利技术的试剂盒，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中， 所述化学发光底物A液，包括10mM鲁米诺、0. 3mM 4-羟基联苯、0. 05mM 4-碘苯硼酸、0. 2M pH8. 7硼酸-硼砂緩冲液，其pH值为8. 0 ~ 10. 0;所述化学发光底物B液，包括3. 5mM过氧化脲、0. 1% Tween20、 0. 2M pH7. 2 磷酸盐緩冲液，其pH值为7.0-7. 6。根据本专利技术的试剂盒，所述浓缩洗涤液包括Na2HP04 . 12H20， 87g; NaH2P04 2H20, 3g; NaCl, 240g; Tween—20, 1. 5mL; Proclin 300, 1. 5mL;双蒸水，定溶至1000mL;调整pH至7. 2 ~ 7. 4。使用时用双蒸水稀释30倍。其次，本专利技术提供了一种制备上述试剂盒的方法。其步骤如下以甲状腺球 蛋白抗体纯品配制校准品；制备曱状腺球蛋白包被的固相栽体；制备辣根过氧化 物酶标记的抗人IgG;配制化学发光底物鲁米诺或异鲁米诺；分装上述校准品、 曱状腺球蛋白包被的固相载体、酶标记物、化学发光底物液；浓缩洗涤液以及 组装为试剂盒。根据本专利技术的方法，所述曱状腺球蛋白包被固相载体包括以下步骤采 用0. 05MpH值为7. 2的磷酸盐緩冲液与适当浓度的曱状腺球蛋白混合制成包 被液，并将其负载于固相载体上；封闭。具体地，所述包4皮方法可以包括1) 包被采用可采用1000mL的0. 05M pH值为7. 2的磷酸盐緩冲液，包含2. 2g 的磷酸二氬钠、12. 9g的磷酸氩钠和9. Og的氯化钠去离子水溶液，与适当 浓度的曱状腺球蛋白混合制成包被液，并将其负栽于固相载体上；2) 封闭配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0. 2g NaH2P04 2H20、 2. 9g NaH2P04 . 12H20、 100 mL牛血清和lmL Proclin 300,所述封闭液的pH值为 7. 0~ 7. 6，然后将所得封闭液负栽于上述固相载体上。在上述方法中，所述固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管，优选的，甲 状腺球蛋白包被的微孔板为48或96孔的微孔板条；在上述方法中，选用过碘酸盐氧化法偶联辣根过氧化物酶与抗人IgG;在上述方法中，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，所述化学发光底物A液，包括lOraM鲁米诺、0. 3mM 4-羟基联苯、0. 05mM 4-碟苯硼酸、0. 2M pH8. 7硼酸-硼砂緩冲液，其pH值为8. 0 ~ 10. 0;所述化学发光底物B液，包括3. 5mM过氧化脲、0. 1% Tween20、 0. 2M pH7. 2 磷酸盐緩冲液，其pH值为7. 0 ~ 7. 6;在上述方法中，所述浓缩洗涤液包括Na2HP04 . 12H20, 87g; NaH2P04 2H20, 3g; NaCl, 240g; Tween-20, 1. 5mL; Proclin 300, 1. 5mL;双蒸水，定溶至1000mL; 调整pH至7. 2~7. 4。使用时用双蒸水稀释30倍；上述试剂盒所述曱状腺球蛋白抗体纯品配制的校准品的原料为标准级，纯度 不低于90%。本专利技术的试剂盒应用酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替 酶联免疫分析中的显色底物，具有与酶联免疫分析同等的特异性，而检测光信号 的灵敏度要比检测显色底物的吸光度要灵敏的多。利用本专利技术的试剂盒进行检测， 灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低， 临床适用性强，更适用于我国中小型医院的临床检测。 附图说明图1为实施例1所制备的试剂盒校准曲线的线性图。 具体实施例方式实施例1制备本专利技术的甲状腺球蛋白抗体化学发光免疫分析测定试剂盒 L、 酶标抗体的制备及酶标抗体浓度选定l.抗人IgG用过碘酸盐氧化法与辣根过氧化物酶偶联，用PBS充分透本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲状腺球蛋白抗体化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组分有：甲状腺球蛋白抗体校准品；甲状腺球蛋白包被的固相载体；辣根过氧化物酶标记的抗人ＩｇＧ；化学发光底物液；以及浓缩洗涤液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：靳辉，应希堂，宋胜利，胡国茂，郑金来，于尚永，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]