本发明专利技术涉及“一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链与轻链可变区基因及其应用”，属于生物技术领域。本发明专利技术提供一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因，并将两条基因重组后获得单链抗体基因，将该单链抗体基因构建载体并转化到大肠杆菌中，其表达产物具有抗原识别活性，能用于水体中微囊藻毒素的检测与监控。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链和轻链可 变区基因序列及其应用。
技术介绍
微囊藻毒素(microcystins,MC)是水华发生时水体中蓝藻爆发性繁殖产生的次生代谢产 物。MCs是一个结构相似的环七肽家族，目前在淡水中已发现80多种不同的MCs(WHO， 2004)，其中MC-LR是目前已知的毒性最强的、急性危害最大的一种淡水蓝藻毒素(Sivonen, 1996;韩志国等，2001)。 MC-LR是一种肝毒素，这种毒素是肝癌的强烈促癌剂，能导致肝坏 死、出血或凋亡(Liu等，2000)。近年来水华频繁出现，面积逐年扩散，我国太湖、滇池、巢湖、洪泽湖都时有发生，严重 威胁着生态安全和人类的饮水安全，因此，对水体中微囊藻毒素进行及时准确的监测非常重 要。如何建立一种简单、快速、灵敏度高的检测手段，以便采取适当措施减少危害，是目前 迫切需要解决的问题。传统检测方法中大多采用HPLC、 LC/MS、 GC等方法检测水体中微囊 藻毒素，这些方法不仅步骤复杂，仪器设备也较昂贵，并不不适合广泛实时的应用。而免疫 分析法以其价格低廉，灵敏度高，可操作性强成为一项值得推广应用的检测技术，免疫检测 是基于抗原-抗体特异性反应的检测方法，在检测水体中的微囊藻毒素方面，由于其检测速度 快，费用低廉而适合大规模样品的快速筛选；其高特异性高灵敏度对于预警检测方面有很广 阔的应用前景。免疫检测整体上是一种理想的检测方法，其关键在于获得特异性和结合亲和力良好的抗体，特别是单克隆抗体。微囊藻毒素这类小分子有机污染物，属于半抗原物质，其免疫原性很弱或者没有免疫原性，即直接以其免疫动物时，很难大量获得或者根本不产生的抗体，必须要载入到大分子载体物质中，才能成为完全抗原；即使获得符合标准的抗体后，这种抗体的大量生产制备也是一项昂贵费时的工作， 一言以蔽之，利用免疫检测方法检测水体中微囊藻毒素，目前为止抗体的大量制备仍然是一个难题。随着基因工程技术的发展起来的重组抗体技术为这个难题的解决带来了福音，重组抗体技术是将单克隆抗体的抗原活性识别区域的基因拼接起来，克隆到常用载体中转化微生物，利用微生物生产单链抗体，这些单链抗体具备原单克隆抗体的抗原结合活性，McElhiney J.等从人噬菌体体库中筛选出一株抗MC-LR单链抗体，能够检测出低于世界卫生组织所规定饮用水标准的指导值(l吗/L) ，因此单链抗体的检测灵敏性得到证实。而重组抗体技术生产单链抗体比传统的单克隆抗体制备方法简单、经济、周期短，因此是免疫检测技术运用中的一项理想的辅助技术，在抗微囊藻毒素的单链抗体制备中有广阔的运用前景。
技术实现思路
本专利技术针对上述领域中的缺陷提供一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链和轻链可变区 基因及其应用，为微囊藻毒素抗体制备提供了简便、经济的途径。一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链可变区基因，其核苷酸序列如Seq ID No.l所示的序列。上述重链可变区基因编码的多肽，其氨基酸序列如SeqIDNo.5所示。 一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的轻链可变区基因，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示的序列。上述轻链可变区基因编码的多肽，其氨基酸序列如SeqlDNo.6所示。 一种单链抗体的基因，其特征在于包括上述如SeqIDNo.l所示的重链可变区基因序列 和如Seq ID No.2所示的轻链可变区基因序列。上述单链抗体的基因，其核苷酸序列如Seq ID No.3所示。 上述单链抗体的基因序列编码的多肽。 上述多肽的氨基酸序列如Seq ID No.4所示。 包含所述单链抗体的基因序列的表达载体pET-MC。 扩增上述重链基因序列的简并引物和特异性引物， 简并引物HFR1: 5'-SAR G TN MAG CTG SAG SAG TCW GG-3,特异性正向引物VH-B : 5'- GGG AAT TCC ATA TGG AGG TTA AGC TGC AGG AGTC-3'，特异性正向弓l物Vh-F: 5'-CCG CTA CCA CCC CCT CCA GAT CCG CCA CCT CCT GAG GAG ACG GTG ACC GT-3';扩增上述轻链基因序列的简并引物和特异性引物，简并引物LFR: 5'-GAY ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3，特异性正向引物VL-B: 5'-CTG GAG GGG GTG GTA GCG GTG GAG GCG GGA GTG ATA TTG TGA TGA CAC AGT C隱3',特异性反向引物VL-F: 5'-GGT CTC GAG TTA CCG TTT GAT TTC CAG CTT GG-3'。上述多肽作为单链抗体在检测及定量微囊藻毒素中的应用。本专利技术采用根据鼠源单克隆抗体的保守区基因序列设计简并引HFR1/LFR，以一株表达 抗MC-LR的单克隆抗体的杂交瘤细胞G5的总RNA为模板，经RT-PCR分别扩增出1500bp和900bp的两个基因片段(图l)。测序后，序列分析表明，扩增的大片段为1473bp，如Seq IDNo.7所示，为单克隆抗体重链的DNA序列，包括部分重链可变区(VH)，完整的CH1、 CH2、 CH3三个恒定区和3'端非编码区，其中VH大小为363bp，编码121个氨基酸；扩增到 较小的片段为880bp如Seq ID No.8所示，为轻链DNA序列，包括部分轻链可变区(VJ， 完整的恒定区和3'非编码区，其中V,.,大小为336bp，编码112个氨基酸。Vh和Vl符合小鼠 免疫球蛋白可变区基因特征，均含有4个框架区(FR)、 3个抗原互补决定区(CDR)及抗体 特征性的2个半胱氨酸残基，且基因内无终止密码子，表明所克隆的序列为鼠源抗体的基因 序歹ll (Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer. Pi OrE/AAS: c'/wre， Fw"ctow a d Ge朋"c、 1996, 25: 130-133);根据扩增得到的片段设计特异性引物 VH-B/VH-F， VL-B/VL-F扩增出该单克隆抗体重链可变区Vh的基因其序列如SeqIDNo.l所示 及轻链可变区V,」的基因其序列如Seq ID No.2所示。本专利技术获得的上述轻链、重链可变区基因序列所编码的多肽具有单克隆抗体抗原结合区 域的氨基酸序列，可作为^链抗体或者多价抗体的组成部分，用于免疫检测或者抗原物质的 定量。本专利技术获得的轻链和重链可变区基因序列可重组成一条单链抗体基因，也可以与其他抗 体的可变区基闲重组成多价抗体基闲，本专利技术中采用重叠延伸PCR扩增法将Seq ID No.l与 Seq ID No.2拼接起來得到单链抗体scFv基因，其中将两条基因序列拼接起来的过渡基因是 p丄选的，轻链与重链的前后顺序也没有特别的要求。本专利技术优选采用Huston等(Huston J S, Leuinson D, Mudgett-Honter M, et al . Protein engineering of an antibody binding site本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗微囊藻毒素的单克隆抗体的重链可变区基因，其核苷酸序列如Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘家荣，宋丽敏，张维，林敏，周洪杰，许园园，吴雅欣，
申请(专利权)人：中国农业科学院原子能利用研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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