复合型硅壳结构的荧光纳米探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种复合型硅壳结构的荧光纳米探针及其制备方法和应用，其特点是先制得复合型硅壳结构的荧光纳米粒子，再通过生物耦连剂使表面氨基化的荧光纳米粒子连接上生物分子，得到既有优异荧光特性又有生物活性，且分散性好、特异性强的生物功能化的荧光纳米探针，其能广泛地应用于生物标记和生物检测等领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于纳米材料学和生物分析化学领域，具体涉及一种生物功能化的罗丹明染料/ 纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米探针及其制备方法和应用。
技术介绍
罗丹明染料(如罗丹明B、罗丹明6G)具有强烈的荧光，被广泛应用于各种生物分析 技术中，包括生物大分子的荧光标记、荧光免疫分析检测及靶向荧光成像等。其中，罗丹 明染料在荧光标记技术中的应用备受关注。利用荧光染料作为标记物己经在生物医学的许多领域，特别是细胞标记和成像中得到 广泛的应用。随着研究的进一步深入，要求检测灵敏度进一步的提高，荧光染料由于其标 记效率低、光稳定性差和相对低的荧光强度等缺点已经限制了其在该领域的应用和发展。 随之而发展起来的硅壳型荧光纳米粒子，由于其克服了荧光染料的光稳定性差和相对低的 荧光强度等缺点，成为新一代最具有发展前景的荧光标记物之一。表面修饰上特异性生物分子的硅壳型荧光纳米探针与光学成像技术相结合，可以实现 对标记分子的靶向观测。但现有的以罗丹明染料直接标记的探针普遍存在荧光效率低，光 稳定性差，染料易泄露等缺点。
技术实现思路
针对现有的荧光纳米探针的缺限与不足，本专利技术的目的是提供一种荧光效率高，粒径 可控，工艺简单，稳定性好的复合型硅壳结构的荧光纳米探针及其在生物医学领域中的应 用。本专利技术的目的通过以下技术方案实现-.一种复合型硅壳结构的荧光纳米探针，是以复合型硅壳结构的荧光纳米粒子为基质材 料，其表面偶联了生物分子；所述复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的外壳成分为二氧化硅，荧光内核是由纳米金及 其表面包裹的罗丹明染料组成。为更好的实现本专利技术的技术方案上述纳米金的粒径优选为25±5 nm，复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的粒径优选为60士10nm。上述生物分子可以是具有生物功能的小分子药物、氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸或 核酸等类别以及生物标记领域公知的其他分子，并完全可以利用公知的技术标记上述复合 型硅壳结构的荧光纳米粒子得到。本专利技术还提供了上述复合型硅壳结构的荧光纳米探针的制备方法，具体包括以下步骤-(1) 复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的制备a. 在纳米金溶液中，按纳米金与罗丹明染料的摩尔比为1:1-4加入罗丹明染料溶液， 反应持续6-12h，得到包裹了染料的纳米金溶液，称为反应液；b. 在磁力搅拌下加入氨水到a.得到的反应液中，调节溶液的pH值在10-11之间；c. 向b.得到的反应液中按纳米金与正硅酸乙酯的摩尔比为1:1-6加入正硅酸乙酯的乙 醇溶液，在磁力搅拌下反应12-24h，即可得到所述复合型硅壳结构的荧光纳米粒子；(2) 步骤(1)所得荧光纳米粒子的氨基化在磁力搅拌下，将复合型硅壳结构的荧 光纳米粒子和氨基丙基三甲氧基硅垸的乙醇溶液以摩尔比为100-500:1的比例反应12-24h， 即可得到氨基化的复合型硅壳结构的荧光纳米粒子；(3) 连接生物分子将氨基化的荧光纳米粒子与生物耦连剂以摩尔比为1-4:1的比例 相混合，再加入待连接的生物分子(1.0-10.0 mg/ml)，在4'C下避光孵育6-12h;离心过滤， 并将标记上生物分子的荧光纳米粒子重新分散在磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0-7.8)中，即可到 连接上生物分子的荧光纳米探针，于4'C以下贮存。所述步骤(1)中，所述纳米金溶液的摩尔浓度优选为1.0xlO—6-5.0xl(T6mol/L;所述罗 丹明染料溶液的摩尔浓度优选为5.0xlO—6-1.0xl(T5mol/L;所述正硅酸乙酯的乙醇溶液的摩 尔浓度优选为1.0xl(T3-5.0xl(r3mol/L;所述纳米金的粒径优选为25±5 nm;所述复合型硅壳 结构的荧光纳米粒子的粒径优选为60±10nm。所述歩骤(2)中，所述氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液的摩尔浓度优选为 1.0xlO-3-5.0xl(T3 mol/L。所述步骤(3)中，所述生物耦连剂可以是本领域常用的偶联剂，但优选乙基3-(3-二甲 氨基)碳二亚胺盐酸盐，其摩尔浓度范围优选0.1-1.0 mol/L。上述生物功能化的复合型硅壳结构的荧光纳米探针既有优异的荧光特性又具有生物活 性，能应用于生物标记和生物检测等领域。利用荧光纳米探针表面固定的生物分子对细胞 表面特异性表达分子的高识别能力，将生物功能化的荧光纳米探针与细胞在37'C孵育，可 以实现对细胞表面特异性分子的准确标记；进一步利用激光共聚焦显微镜可以实现对细胞5表面特异性分子的荧光识别。相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果本专利技术将复合型硅壳结构的荧光纳米粒子表面氨基功能化，然后通过酰胺键与生物分 子相连，实现了复合型硅壳结构的荧光纳米粒子表面的生物功能化及其在细胞标记上的应 用。本专利技术的方法通过结合高特异型的分子识别和荧光纳米探针的信号放大作用来提高荧 光标记的准确性。生物功能化的荧光纳米探针制备简单、步骤较少、荧光效率较高，能实 现对细胞表面特异性分子的荧光标记。在生物标记和生物检测领域具有一定的应用前景。附图说明图1为生物功能化的罗丹明染料/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米探针的结构 示意图。图2为复合型硅壳结构的荧光纳米探针标记宫颈癌细胞3h后的激光共聚焦显微镜图。 其中，A使用表面标记上转铁蛋白分子荧光纳米探针，B使用未标记上生物分子的荧光纳 米探针。具体实施例方式下面结合实施例，对本专利技术做进一步地详细说明，但本专利技术的实现方式并不局限于此。 实施例1转铁蛋白标记的罗丹明B/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米探针 对宫颈癌细胞的特异性标记(1) 罗丹明B/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的制备采用氯金酸-柠檬酸钠还原法制备粒径为25±5 nm的纳米金溶液；再向纳米金溶液中加 入摩尔比为1:1的罗丹明B溶液(5.0xl(T6 mol/L)，反应持续6h，得到包裹上罗丹明B染 料的纳米金溶液，称为反应液。通过氨水调节反应液的pH值在10-11之间。在磁力搅拌下， 向上述反应液中按纳米金与正硅酸乙酯的摩尔比为1:1加入正硅酸乙酯的乙醇溶液 (l.Oxl(T3 mol/L)，在磁力搅拌下反应12h，即可得到粒径为50 60 nm的罗丹明B/纳米金/ 二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米粒子。(2) 氨基化的荧光纳米粒子与生物分子的连接在磁力搅拌下，将复合型硅壳结构的 荧光纳米粒子和氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液(l.Oxl(T3 mol/L)以摩尔比为100:1的 比例反应12h，即可得到氨基化的复合型硅壳结构的荧光纳米粒子；将氨基化的荧光纳米 粒子与O.l mol/L生物耦连剂(乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐)以摩尔比为l:l的比 例相混合，再加入待连接的生物分子(1.0mg/ml)，在4。C下避光孵育12h。以5000rpm的速度，离心过滤10min，并将标记上生物分子的荧光纳米粒子重新分散在磷酸盐缓冲溶液 (pH 7.0-7.8)中，即可到标记上转铁蛋白分子的荧光纳米探针，于4。C贮存。G)生物功能化的荧光纳米探针对宫颈癌细胞上特异表达的转铁蛋白受体的特异性识 别利用生物功能化的荧光纳米探针表面固定的转铁蛋白分子对宫颈癌细胞表面高度表达 的转铁蛋白受体的特异性识别，将标记上转铁蛋白分子的荧光纳米探针与宫颈癌细胞在 37"C孵育3h。将细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复合型硅壳结构的荧光纳米探针，其特征在于：是以复合型硅壳结构的荧光纳米粒子为基质材料，其表面偶联了生物分子；　所述复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的外壳成分为二氧化硅，荧光内核是由纳米金及其表面包裹的罗丹明染料组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡怀鸿，蔡继业，杨培慧，徐萌，朱新海，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]