一种短肽及其制备方法和在诊断或治疗与PACAP、VIP相关疾病中的应用技术

本发明专利技术公开一种短肽及其制备方法和在诊断或治疗与ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ相关疾病中的应用，该短肽序列为组氨酸－丝氨酸－天冬氨酸－甘氨酸－异亮氨酸，通过在短肽的首尾添加两个半胱氨酸，两个半胱氨酸的巯基形成二硫键从而环化成环七肽。本发明专利技术的环七肽，包括Ｈｉｓ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ序列，从而能够特异地调节体内ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ的活性，同时也可逆转体内的ＰＡＣＡＰ（６－３８）及ＰＡＣＡＰ（６－２７）的拮抗作用，具有广阔的应用前景和较高的应用价值。本发明专利技术的环七肽能够用于诊断以及治疗与ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ相关的疾病，医用价值高，而且环七肽通过操作简单的固相合成法即可以获得，因此具有很广阔市场前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有药理作用的多肽，具体涉及一种短肽及其制备 方法和在诊断或治疗与PACAP、 VIP相关疾病中的应用。
技术介绍
垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)是1989年发现的，由脑垂体分泌的具有重要生物学功 能的神经多肽，属于是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。PACAP在动物进化过程中相当保守，脊椎动物青蛙和人的PACAP只有2 个氨基酸的差异，显示PACAP执行关键的生理学功能。PACAP及其受体 (PAC1、 VPAC1和VPAC2)在机体分布及其广泛，不仅分布于中枢神经系统、 周围神经系统，而且在非神经组织内也广泛存在，如脑、睾丸、卵巢、呼吸道、 肺、胰腺、脂肪组织等。目前已证实PACAP具有神经递质/调质、保护神经细胞；促进激素分泌， 调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生；参与消化活动，调节能量 代谢平衡；参与调节免疫系统等生物学功能。体内的PACAP有两种形式PACAP27和PACAP38， PACAP27是PACAP38 的N端27个氨基酸。体内PACAP在二基肽酶(dipeptidylpeptidase， IVDPP IV)的 作用下失去N端的五个氨基酸——His-Ser-Asp-Gly-Ile形成的PACAP(6—27) 和PACAP(6—38)是PACAP的拮抗剂。因此PACAP的N端五个氨基酸组成的短肽(His-Ser-Asp-Gly-Ile)对于维持PACAP的活性和功能是非常重要的。目前 尚未有用线性五肽His-Ser-Asp-Gly-Ile调控PACAP以及VIP活性的报道。与PACAP有高度同源性的血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP) 也具有和PACAP相似的N端，而且VIP同PACAP—样都受到二基肽酶的降解从 而成为自身的拮抗剂，因此His-Ser-Asp-Gly-Ile也具有调控体内VIP活性的作 用。然而线性五肽在体内非常不稳定，相反环肽主链呈环状结构，具有一定的 构象约束作用，其构象相对线型肽有一定的稳定性，其抗酶解能力比线型肽强， 所以可以考虑将His-Ser-Asp-Gly-Ile环化后提高其在体内的稳定性以及抗酶解 能力。目前尚未有将His-Ser-Asp-Gly-Ile环化后调控PACAP以及VIP活性的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能有效干预体内 PACAP、 VIP等神经肽的活性，逆转PACAP(6-27)或PACAP(6-38)的拮抗功會巨， 从而协助体内的PACAP、 VIP发挥多种重要生物学功能的，构象稳定且抗酶 解能力强的短肽。本专利技术的另一个目的是提供将上述短肽制成稳定性好的环七肽。 本专利技术的另一个目的在于提供上述环七肽的制备方法。 本专利技术的进一步目的在于提供上述短肽或环七肽在诊断或治疗与 PACAP、 VIP相关的疾病中的应用。本专利技术的上述目的是通过如下方案予以实现的本专利技术经过大量的研究发现，短肽组氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸(His-Ser-Asp-Gly-Ile)对于维持APCAP、 VIP的活性和功能是非常重要的， 然而这五肽的线性结构使得其在体内非常不稳定。为了在克服该问题，本专利技术 通过在该五肽的两端设计一些氨基酸或基团(如半胱氨酸或甲基)，使得生成 后的肽链为环肽结构，则不但能起到调节APCAP、 VIP活性的作用，又能保证 肽链在体内的构象稳定，以及较强的抗酶解能力。本专利技术优选半胱氨酸对五肽进行环化，实现从线性多肽到环肽结构的转 换。在His-Ser-Asp-Gly-Ile的两端分别添加半胱氨酸Cys，首尾两个半胱氨酸的 巯基形成分子内二硫键，从而生成构象稳定且能有效抵抗氨肽酶和羧肽酶酶解 的环七肽。其结构式为环-(半胱氨酸-组氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-异亮氨 酸-半胱氨酸)cyclo- (Cys-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Cys)。在多肽合成中，每生成一个肽键，都需要经过官能团保护、縮合、去保护 等操作步骤，加上每一步产物的分离纯化，操作相当复杂而且费时，因此现在 多釆用固相合成法进行多肽的合成。固相合成法有两种，即Fmoc和tBoc，由于Fmoc比tBoc存在更多优势，所 以大多又采用Fmoc法合成多肽。本专利技术环七肽的合成采用固相合成法，优选Fmoc法。本专利技术环七肽的合成方法包括如下步骤(1) 以Fmoc氨基酸为原料，采用固相合成法，获得直链肽；(2) 直链肽的环化；(3) 用切割试剂切割脱离树脂得到粗产品，反相高效液相色谱纯化得到环 七肽。上述步骤(1)中，固相合成法所采用的縮合剂为TBTU/HOBT/DIEA复合縮合剂；TBTU: 0-(7-偶氮苯并三氮唑-l-氧)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HOBT: N-羟基苯并三唑；DIEA: N，N'-二异丙基乙胺；该TBTU/HOBT/DIEA复合縮合剂为Fmoc法中常用的縮合剂，其配方以及用量均为本领域技术人员 共知的，此处的Fmoc法也是本领域的通用方法，其操作方法可参考相关教科 书。上述步骤(2)中，直链肽的环化是剪切前在树脂上进行的，如直链 Cys-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Cys的环化就是在剪切前，对Fmoc保护的巯基进行树 脂上的氧化，从而将线性五肽转变成环七肽结构；氧化剂可以为任意一种氧化 剂，如12、 H202、 Hg"盐、K3Fe(CN)6、三氟乙酸铊T"tfa)3、氯硅烷-砜类氧化 剂或二甲基亚砜DMSO等。上述步骤(2)， (3)中的直链肽环化，切割试剂切割以及反向高相液相色 谱RP-HPLC纯化等步骤均为本领域的常规技术。动物实验结果表明本专利技术的环七肽能有效干预体内PACAP的活性，提 高PACAP介导的生物学功能，还可以与天然拮抗剂PACAP(6-27)或PACAP(6-3 8) 互补，逆转其拮抗作用，促进激动作用，提高体内PACAP对受体的激动力和 作用时效，目前还没有类似作用机制的报道。由于血管活性肠肽VIP与PACAP具有高度同源性，并且具有相似的N端， 所以本专利技术的环七肽也具有调控体内VIP活性的作用。因此，本专利技术的环七肽可以用于诊断以及治疗与PACAP、 VIP相关的疾病， 由于PACAP、 VIP在生物进化过程中非常保守，具有广泛而重要的生物功能， 所以本专利技术环七肽可能治疗的疾病覆盖神经系统、内分泌系统、消化与能量代 谢、心血管循环、生殖系统与免疫系统，如糖尿病(包括I型、II型)、肥胖、肥胖相关疾病、代谢障碍、代谢相关综合症、脑损伤、脑缺血、防止神经细胞 死亡、受损神经细胞保护及再生、抗炎、男性阳痿、性冷淡、不孕不育、女性 性功能障碍，神经痛、神经病、神经混乱、焦虑症、精神病，记忆损伤、痴呆、 认知混乱、中枢神经系统疾病、偏头痛、神经畏縮、心肌缺血、心肌梗死/纤 维化、动脉硬化、肌畏縮症、胃溃疡、高血压、内毒性休克、血栓症、视网膜 病变、心血管疾病、肾衰竭、心衰竭、肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞增殖等。 与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果1. 本专利技术的环七肽，包本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种短肽，其氨基酸序列为组氨酸－丝氨酸－天冬氨酸－甘氨酸－异亮氨酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余榕捷，
申请(专利权)人：余榕捷，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]