【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗体制备，具体涉及一种抗原特异性浆细胞的筛选方法及其应用。
技术介绍
1、单抗（单克隆抗体）具有高特异性和亲和力，现已被广泛应用于病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病等疾病的诊断和治疗，而高质量的单抗对于疾病治疗和开发高性能免疫诊断试剂是重中之重。因此，快速、高效的抗体发现技术对于抗体药物的研发以及疾病的诊疗具有重要的意义。
2、浆细胞（plasma cell，pc）又称抗体分泌细胞（antibody secreting cell，asc），其是免疫系统中释放大量抗体的最成熟b细胞，单抗是由单一b细胞克隆产生的高度均一且仅针对某一特定抗原表位的抗体，而抗体是机体由于抗原的刺激由浆细胞分泌产生的，因此直接筛选单个抗原特异性的浆细胞是单抗发现最理想、最直接以及最高效的方式，也是单抗发现技术的核心。
3、此外，机体外周血中浆细胞的数量不多，通常经免疫后约50个抗原特异性浆细胞/10000个浆细胞，因此筛选准确率更高、后续测序和表达成本更低。然而，浆细胞的膜表面没有膜结合抗体，抗体一旦成熟就会分泌出去，而且浆细胞又没有办法在体外长期培养，单细胞分泌的抗体量十分少，分泌的抗体难以被检测到，因此，直接筛选单个抗原特异性的浆细胞十分困难。
4、为了解决筛选单个抗原特异性的浆细胞十分困难的问题，相关技术人员开发了一种捕获二抗的微孔阵列，每个微孔刚好可以容纳单个浆细胞，把浆细胞分布到每个微孔中培养3.5个小时，浆细胞分泌的抗体则被二抗捕获，然后加入偶联荧光染料的抗原进行染色，则强荧光的孔中
5、另外，相关技术人员还开发了一种基于光镊技术的筛选浆细胞的beacon®系统，该系统包括一块分隔了很多小腔室的微流控芯片以及一套光镊设备，每个浆细胞被分到每个小腔中培养一段时间，然后通过偶联了抗原的微球以及偶联了荧光的二抗对培养上清进行显色，使用光镊系统对强荧光的腔室中的浆细胞分离出来进行测序即可得到抗体序列。
6、虽然上述两种技术均可以实现单个抗原特异性的浆细胞的筛选，但是每套仪器的成本均较高，且操作复杂，筛选时间长。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种抗原特异性浆细胞的筛选方法及其应用，旨在解决现有技术筛选单个抗原特异性的浆细胞的成本较高，且操作复杂，筛选时间长的问题。
2、第一方面，本专利技术提供了一种抗原特异性浆细胞的筛选方法，其包括以下步骤：
3、s1、将待抗种属的特异性抗体与2-it溶液进行第一次反应，并对反应后的特异性抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的特异性抗体；
4、将待标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体与smcc溶液进行第二次反应，并对反应后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体；
5、将复溶后的特异性抗体和复溶后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体混匀，在低温下反应搅拌混匀得到双特异抗体；
6、s2、使用cb溶液将待标记的抗原稀释成10mg/ml的抗原溶液，并将抗原溶液装入透析袋内；使用cb溶液将荧光素稀释成0.1mg/ml的荧光素溶液；将透析袋封口并浸入荧光素溶液内，进行搅拌；吸取透析袋内的溶液，使用sephadex g-25柱层析去除游离荧光素，得到荧光抗原；
7、s3、提取pbmc，加入抗cd16/32的抗体封闭pbmc的fc受体，进行第一次孵育；将双特异抗体加入第一次孵育后的pbmc中进行反应，并对反应后的所述pbmc进行第一次离心洗涤；将进行第一次离心洗涤后的所述pbmc以10000~1000000个/ml的密度进行培养，并对培养后的所述pbmc进行第二次离心洗涤；将所述荧光抗原和荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第二次孵育，并对第二次孵育后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第三次离心洗涤，获得带有荧光的细胞，带有荧光的细胞即为抗原特异性浆细胞；
8、s4、通过单细胞分离技术将单个抗原特异性浆细胞分离出来，得到单个抗原特异性浆细胞。
9、优选的，所述步骤s1中，所述第一次反应和所述第二次反应分别采用旋转培养器进行；所述待抗种属的特异性抗体和所述待标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体的质量均是0.1 mg；所述2-it溶液的容积为2μl，浓度为6 mg/ml；第一次反应时旋转培养器的温度为25℃，反应的时间为60min；所述缓冲液为0.05m且ph值为7.0的pbs缓冲液。
10、优选的，所述步骤s1中，所述smcc溶液的容积为6μl，浓度为7 mg/ml；第二次反应时旋转培养器的温度为25℃，反应的时间为30min；混匀时采用冰箱进行且温度为4℃，混匀时间为18h。
11、优选的，所述步骤s2中，所述cb溶液的浓度为0.025mol/l，ph值为9.0；所述搅拌采用电磁搅拌器进行。
12、优选的，所述步骤s2中，浸入荧光素溶液内时所述荧光素溶液的体积为所述抗原溶液的10倍；将所述透析袋浸入所述荧光素溶液内后，处于4℃的环境下，使用电磁搅拌器进行搅拌，搅拌的时间为18~24h，且所述荧光素溶液装于烧杯内。
13、优选的，所述步骤s3中，所述抗cd16/32的抗体的质量为2μg；所述第一次孵育和所述第二次孵育的过程均处于4℃的环境下进行，所述第一次孵育的时间为5~10min，所述第二次孵育的时间为20min；所述培养采用细胞培养箱进行。
14、优选的，所述步骤s3中，将所述荧光抗原和荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第二次孵育时，所述荧光抗原和所述荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体的质量均为1μg；所述第一次离心洗涤、所述第二次离心洗涤以及所述第三次离心洗涤的次数均为3次。
15、第二方面，本专利技术提供了一种抗原特异性浆细胞的筛选方法在单克隆抗体制备中的应用，将上述筛选得到的单个抗原特异性浆细胞进行dna提取、扩增测序，得到特异性单克隆抗体基因，对所述特异性单克隆抗体基因进行重组表达，获取单克隆抗体。
16、第三方面，本专利技术提供了一种单克隆抗体的获取方法，其包括以下步骤：
17、s1、将待抗种属的特异性抗体与2-it溶液进行第一次反应，并对反应后的特异性抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的特异性抗体；
18、将待标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体与smcc溶液进行第二次反应，并对反应后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行过滤脱盐，使用缓冲液复溶进行过滤脱盐后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体；
19、将复溶后的特异性抗体和复溶后的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体混匀，在低温下反应搅拌混匀得到双特异抗体；
20、s2、使用cb溶液将待标记的抗原稀释成10mg/ml的抗原溶液，并将抗原溶液装本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述第一次反应和所述第二次反应分别采用旋转培养器进行；所述待抗种属的特异性抗体和所述待标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体的质量均是0.1 mg；所述2-IT溶液的容积为2μL，浓度为6 mg/mL；第一次反应时旋转培养器的温度为25℃，反应的时间为60min；所述缓冲液为0.05M且pH值为7.0的PBS缓冲液。
3.如权利要求2所述的抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述SMCC溶液的容积为6μL，浓度为7 mg/mL；第二次反应时旋转培养器的温度为25℃，反应的时间为30min；混匀时采用冰箱进行且温度为4℃，混匀时间为18h。
4.如权利要求1所述的抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述CB溶液的浓度为0.025mol/L，pH值为9.0；所述搅拌采用电磁搅拌器进行。
5.如权利要求4所述的抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，所述步骤S
6.如权利要求1所述的抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述抗CD16/32的抗体的质量为2μg；所述第一次孵育和所述第二次孵育的过程均处于4℃的环境下进行，所述第一次孵育的时间为5~10min，所述第二次孵育的时间为20min；所述培养采用细胞培养箱进行。
7.如权利要求6所述的抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，所述步骤S3中，将所述荧光抗原和荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体进行第二次孵育时，所述荧光抗原和所述荧光标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体的质量均为1μg；所述第一次离心洗涤、所述第二次离心洗涤以及所述第三次离心洗涤的次数均为3次。
8.一种抗原特异性浆细胞的筛选方法在单克隆抗体制备中的应用，其特征在于，将权利要求1-7任意一项筛选得到的单个抗原特异性浆细胞进行DNA提取、扩增测序，得到特异性单克隆抗体基因，对所述特异性单克隆抗体基因进行重组表达，获取单克隆抗体。
9.一种单克隆抗体的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.如权利要求9所述的单克隆抗体的获取方法，其特征在于，所述步骤S6完成后，还包括步骤：S7、将所述单克隆抗体进行配对验证。
...【技术特征摘要】
1.一种抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，所述步骤s1中，所述第一次反应和所述第二次反应分别采用旋转培养器进行；所述待抗种属的特异性抗体和所述待标记的抗浆细胞特异的表面标记分子的抗体的质量均是0.1 mg；所述2-it溶液的容积为2μl，浓度为6 mg/ml；第一次反应时旋转培养器的温度为25℃，反应的时间为60min；所述缓冲液为0.05m且ph值为7.0的pbs缓冲液。
3.如权利要求2所述的抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，所述步骤s1中，所述smcc溶液的容积为6μl，浓度为7 mg/ml；第二次反应时旋转培养器的温度为25℃，反应的时间为30min；混匀时采用冰箱进行且温度为4℃，混匀时间为18h。
4.如权利要求1所述的抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，所述步骤s2中，所述cb溶液的浓度为0.025mol/l，ph值为9.0；所述搅拌采用电磁搅拌器进行。
5.如权利要求4所述的抗原特异性浆细胞的筛选方法，其特征在于，所述步骤s2中，浸入荧光素溶液内时所述荧光素溶液的体积为所述抗原溶液的10倍；将所述透析袋浸入所述荧光素溶液内后，处于4℃的环境下，使用电磁搅拌器进行...
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