锌荧光探针制造技术

作为锌荧光探针有用的用通式（ＩＡ）表示的化合物或其盐，其中［Ｒ＃＋［１］和Ｒ＃＋［２］表示氢原子或者用下述式（Ａ）表示的基团（式中，Ｘ＃＋［１］、Ｘ＃＋［２］、Ｘ＃＋［３］和Ｘ＃＋［４］表示氢原子、烷基、２－吡啶基甲基或者氨基的保护基，ｍ和ｎ表示０或１），Ｒ＃＋［１］和Ｒ＃＋［２］不能同时是氢原子；Ｒ＃＋［３］和Ｒ＃＋［４］表示氢原子或者卤原子；Ｒ＃＋［５］和Ｒ＃＋［６］表示氢原子、烷基羰基或者烷基羰基氧基甲基，Ｒ＃＋［７］表示氢原子或者烷基］。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及特异性捕集锌离子并发出荧光的锌荧光探针。
技术介绍
锌在人体内是仅次于铁含量多的必须金属元素，细胞内大部分的锌离子和蛋白质牢固地结合，与蛋白质的结构保持和机能表现有关。另外，对于细胞内极其微量存在的游离锌离子(通常是μM水平以下)的生理作用，也有种种的报导。特别是，一般认为锌离子和细胞死因之一的细胞程序死亡有很深的关系，也有阿尔兹海默病促进老人斑形成等报导。以往，为了测定组织内的锌离子，特异性捕集锌离子并形成络合物，使用随着络合物的形成而发出荧光的化合物(锌荧光探针)。作为锌荧光探针，例如已经实用化的TSQ(Reyes，J.G.等人，Biol.Res.，27，49，1994)、Zinquin乙酯(Tsuda，M.等人，Neurosci.，17，6678，1997)、丹磺酰基氨基乙基环楞胺(Koike，T等人，J.Am.Chem.Soc.，118，12686，1996)、Newport Green(作为Molecular Probe公司的商品目录的“Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals”第6版，Richard P.haugland pp.531-540)等。 但是，使用TSQ、Zinquin或者丹磺酰基氨基乙基环楞胺的测定由于需要使用短波长范围的激发光(激发波长分别是367nm、368nm和323nm)，在将这些锌荧光探针用于生物体系统的测定时，由短波长产生的激发可能引起细胞伤害(细胞工学，17，pp.584-595，1998)，另外，测定时，细胞系统自体易于受到具有的自体荧光(NADH和黄素类发出的荧光)产生的影响这样的问题。而且，丹磺酰氨基乙基环楞胺在测定时具有由于试剂存在的环境的差别，即溶剂的种类或者在细胞外、细胞内或者细胞膜等中的水溶性、脂溶性等的环境的差别，而使荧光强度发生很大变化这样的缺点(蛋白质·核酸·酶·增刊号，42，pp.171-176，1997)，TSQ也具有由于脂溶性高而使细胞全体均匀分布困难这样的问题。Newport Green虽然可以用长波长激发光进行测定，但是具有和锌离子的亲和性低，不具有实用的测定灵敏度这样的问题。因而，一直在谋求开发不会引起细胞障碍且可以高灵敏度测定锌离子的锌荧光探针。专利技术公开本专利技术的课题在于提供可以作为高灵敏度的锌荧光探针而加以利用的化合物或者其盐。更具体地说，本专利技术的课题是提供一种化合物，该化合物可以特异性捕集锌离子，捕集后络合物的荧光强度优良，可以作为能够用长波长激发光测定的锌荧光探针而加以利用。再者，本专利技术另外的课题在于提供含有具有上述特征的化合物的锌荧光探针以及使用该锌荧光探针的锌离子的测定方法。本专利技术者们为了解决上述课题，进行了锐意研究，结果发现了以环状胺或者聚胺为取代基的化合物对于锌离子具有高的特异性，捕集锌离子，形成用长波长范围内的激发光发出强的荧光的络合物(特愿平11-40325)。本专利技术者们进一步反复研究，发现了用下述通式(I)表示的化合物极其迅速地形成和锌的络合物，发出强的荧光。还发现了如果用下述通式(I)表示的化合物作为锌荧光探针，则和生物体内的锌离子即刻反应，由于形成荧光性的络合物，可以极其正确且高灵敏度地测定生物体内的锌。基于这些知识，完成了本专利技术。即，本专利技术提供了用下述通式(IA)或(IB)表示的化合物或其盐 。作为上述专利技术优选的方式，提供用下述通式(II)表示的化合物或其盐 (式中，R13和R14分别独立地表示氢原子或卤原子；R17表示氢原子或烷基；R18表示氢原子或氨基的保护基)。根据本专利技术优选的方式，可以提供R17和R18是氢原子的上述化合物或其盐，根据更优选的方式，可以提供对于用-COOR17表示的基团，苯环上的取代氨基结合到间位或对位上的化合物或其盐。另外，根据本专利技术，可以提供用下述通式(IIIA)或(IIIB)表示的化合物或其盐 。根据本专利技术优选的方式，可以提供对于用-COOR27表示的基团(形成内酯环时对应的羰基)，苯环上的Y结合到间位上的化合物。从另外的观点来看，根据本专利技术，可以提供含有用上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保护基的化合物除外)或者含有这些化合物的盐的锌荧光探针；以及由上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保护基的化合物除外)或者这些化合物的盐和锌离子形成的锌络合物。该锌荧光探针可以用于测定组织和细胞内的锌离子。从进一步的观点来看，根据本专利技术，可既提供了锌离子的测定方法，也提供了将用上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保护基的化合物除外)或者这些化合物的盐用作锌荧光探针的方法；锌离子的测定方法，其特征在于包含以下工序(a)使上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保护基的化合物除外)或者这些化合物的盐和锌离子反应的工序，以及(b)测定在上述工序中生成的锌络合物的荧光强度的工序；并且将上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是引入氨基的保护基的化合物除外)或者这些化合物的盐用作锌荧光探针。用上述通式(I)、通式(II)或者用通式(III)表示的化合物(但是只限于引入氨基的保护基的化合物)作为用于制造上述锌荧光探针的中间体是有用的。图面的简单说明附图说明图1表示本专利技术的锌荧光探针(化合物6)对于锌离子具有优良的选择性。图2表示本专利技术的锌荧光探针(化合物12)对于锌离子具有优良的选择性。图3表示本专利技术的锌荧光探针(化合物21)对于锌离子具有优良的选择性。图4表示将本专利技术的锌荧光探针(化合物6和化合物12)的荧光强度的时间变化和具有环状聚胺部分的ACF-1进行比较的结果。图5表示本专利技术的锌荧光探针(化合物6和化合物12)的荧光强度和锌离子浓度的关系。图6表示化合物12以及化合物21和它们的锌络合物的荧光强度的变化对于pH的变化。图7表示使用大鼠的海马切片来研究由缺血刺激产生的荧光强度的变化的结果。图8表示使用大鼠的海马切片来研究在不同区域由缺血刺激产生的荧光强度的变化的结果。实施专利技术的最佳方式将日本国专利申请的2000-50869号说明书公开的全部作为参考，包含在本说明书的公开中。在本说明书中，“烷基”或者含有烷基部分的取代基(例如烷基羰基或烷基羰基氧基甲基等)的烷基部分是指例如碳原子数为1-12个，优选碳原子数1-6个，优选碳原子数1-4个的直链、支链、环状、或者它们的组合组成的烷基。更具体地说，作为烷基，优选低级烷基(碳原子数1-6个的烷基)。作为低级烷基，例如可以列举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、环丙基甲基、正戊基、正己基等。在本说明书中，在卤原子的情况下，氟原子、氯原子、溴原子或者碘原子都可以，优选氟原子、氯原子或溴原子。对氨基保护基的种类没有特别的限定，例如可以适当利用对硝基苯磺酸基、三氟乙酰基、三烷基甲硅烷基等。关于氨基的保护基，例如可以参照“有机合成中的保护基”，T.W.Green著，John Wiley & Sons有限公司(1981年)等。在上述通式(IA)本文档来自技高网...

【技术保护点】
用下述通式（ⅠＡ）或（ⅠＢ）表示的化合物或其盐：＊＊＊式中，Ｒ↑［１］和Ｒ↑［２］分别独立地表示氢原子或者用下述式（Ａ）表示的基团＊＊＊（Ａ）式中，Ｘ↑［１］、Ｘ↑［２］、Ｘ↑［３］和Ｘ↑［４］分别独立地表示氢原子、烷基、２－吡啶基甲基或者氨基的保护基，ｍ和ｎ分别独立地表示０或１，Ｒ↑［１］和Ｒ↑［２］不能同时是氢原子；Ｒ↑［３］和Ｒ↑［４］分别独立地表示氢原子或者卤原子；Ｒ↑［５］和Ｒ↑［６］分别独立地表示氢原子、烷基羰基或者烷基羰基氧基甲基，Ｒ↑［７］表示氢原子或者烷基。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：长野哲雄，菊地和也，平野智也，
申请(专利权)人：第一化学药品株式会社，长野哲雄，
类型：发明
国别省市：JP[日本]