定量胆固醇的方法技术

公开了选择性定量胆固醇的方法，包括在与样本中的非测量脂蛋白具有较强亲合性的化合物、对测量脂蛋白表现较强作用的表面活性剂和胆固醇测定试剂的存在下，测定样本中的测量脂蛋白部分中胆固醇的量；选择性测定胆固醇的量的方法，包括在与样本中的测量脂蛋白具有较强亲合性的化合物、对非测量脂蛋白表现较强作用的表面活性剂和胆固醇测定试剂的存在下，优先使存在于样本中非测量脂蛋白中的胆固醇反应，再测定剩余测量脂蛋白中胆固醇的量；和胆固醇的定量测定试剂，单独或作为混合物包含用于进行上述方法的与样本中脂蛋白之一具有较强亲合性的化合物、对其他脂蛋白表现较强作用的表面活性剂和胆固醇测定试剂。该方法和试剂确保通过简单操作有效地定量测定特殊脂蛋白部分中的胆固醇，无需离心等预处理。该方法和试剂能够适用于各种类型的自动分析仪。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及胆固醇的定量测定方法，该方法能够区分地定量测定特定脂蛋白部分中的胆固醇含量，利用少量样本经过简单操作即可实现。
技术介绍
胆固醇等脂质在血清中与脱辅基蛋白质结合形成脂蛋白。根据它们的物理性质，脂蛋白分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。在这些脂蛋白中，LDL是引起动脉硬化的物质之一，而HDL已知表现出抗动脉硬化作用。从流行病学观点来看，LDL中的胆固醇值与动脉硬化发生频率具有正向的相互关系，而HDL中的胆固醇值已知与动脉硬化发生频率具有反向的相互关系。当今，经常出于缺血性心脏病的预防和诊断目的而测量HDL和LDL中的胆固醇值。已知作为测量HDL和LDL中的胆固醇的方法，例如通过超速离心从其他脂蛋白中各分离HDL和LDL后测量胆固醇的方法、通过电泳分离HDL和LDL、对脂质进行染色再测量颜色强度的方法。不过，这些已知方法中没有一种用于每天的实践，其原因例如操作复杂、不能处理大量样本等。广泛用在临床检查领域中的测量HDL中的胆固醇的方法是一种沉淀方法，包括向样本中加入沉淀剂，引起除HDL以外的脂蛋白聚集，通过离心除去聚集物，测量仅含有HDL的上清液中的胆固醇。尽管与超离心方法和电泳分析相比，这种方法简单易行，不过该方法不仅由于要加入沉淀剂进行分离操作而要求比较大量的样本，而且涉及巨大风险的分析误差。因此，全部分析操作的完全自动化已是不可能的。已经研究了HDL中的胆固醇的区分酶测定方法。例如，在胆汁盐和非离子表面活性剂的存在下的酶反应是已知的(日本专利申请公开No.126498/1988)。这种方法利用酶反应的进行在最初阶段与LDL胆固醇浓度成比例而在后面阶段与HDL胆固醇浓度成比例这一性质。不过，该方法的分析精度是有问题的，因为完全区分HDL中的胆固醇反应与其他脂蛋白中的胆固醇反应是不可能的。另一种本领域已知的方法包括预先聚集除HDL以外的脂蛋白，仅使HDL中的胆固醇进行酶反应，灭活酶，与此同时重新溶解聚集物，测量吸光度(日本专利申请公开No.242110/1994)。不过，这种方法仅能适用于有限的自动分析仪，因为要求试剂至少加入三次。因此，该方法的普遍性是有限的。从对分析仪器的损害和试剂的处理等观点来看，该方法也是不令人满意的，因为沉淀的重新溶解要求使用高浓度盐等。日本专利No.2600065公开了使用常规沉淀法所用的用于沉淀除HDL以外的脂蛋白的沉淀试剂和常用于胆固醇测量的试剂测量HDL中还没有沉淀出来的胆固醇的方法。所公开的具体实例是改性酶与硫酸α-环糊精的组合。其他方法包括使用表面活性剂降低沉淀剂干扰的方法(日本专利申请公开No.116996/1996)、代替常规沉淀试剂而使用用于沉淀除HDL以外的脂蛋白的抗体的方法(日本专利申请公开No.96637/1997)、使用角叉菜胶的方法(日本专利申请公开No.121895/1997)和使用糖化合物的方法(日本专利申请公开No.301636/1995)。这些方法所具有的问题例如即使在混合正常血清的情况下也会因聚集作用而形成浑浊，要求聚集除HDL以外的脂蛋白(LDL、VLDL等)，而它们的测量是不必要的等。作为临床检查领域广泛接受的测量LDL中的胆固醇的方法，Friedwald的方法(《临床化学》18卷459-502页(1972))是已知的。按照这种方法，利用由酶方法所测定的总胆固醇、HDL胆固醇和甘油三酯的量测定LDL胆固醇的量。不过，当甘油三酯的浓度超过400mg/dl时，不能适用这种方法。因此，本专利技术的目的是提供特定部分中的胆固醇的定量测定方法，该方法不要求离心等预处理，通过简单操作即可进行，能够适用于各种类型的自动分析仪。专利技术的公开作为深入研究的结果，本专利技术的专利技术人已经发现，如果在与样本中脂蛋白之一具有较强亲合性的化合物和对样本中其他脂蛋白表现较强作用的表面活性剂的存在下进行胆固醇测定酶试剂的反应，则有可能提供样本中特定脂蛋白所含有的胆固醇的反应与包括在其他脂蛋白中的胆固醇的反应之间的显著性差异，由此能够区分并测定目标脂蛋白中的胆固醇，基本上具有足够高的精度。具体而言，本专利技术提供选择性，包括在与样本中的非测量脂蛋白具有较强亲合性的化合物、对测量脂蛋白表现较强作用的表面活性剂和胆固醇测定试剂的存在下，测定在样本中的测量脂蛋白部分中的胆固醇的量。本专利技术进一步提供选择性测定胆固醇的量的方法，包括在与样本中的测量脂蛋白具有较强亲合性的化合物、对非测量脂蛋白表现较强作用的表面活性剂和胆固醇测定试剂的存在下，优先使存在于样本中非测量脂蛋白中的胆固醇反应，再测定剩余测量脂蛋白中胆固醇的量。本专利技术进一步提供测定不同脂蛋白中胆固醇浓度的方法，包括在与样本中第一种测量脂蛋白具有较强亲合性的化合物、与第一种脂蛋白相比对第二种脂蛋白表现相对更强作用的表面活性剂和胆固醇测定试剂的存在下，优先使存在于样本中第二种测量脂蛋白中的胆固醇反应，测定剩余第一种测量脂蛋白中胆固醇的量，再从所得剩余第一种测量脂蛋白中胆固醇的量和总胆固醇浓度测定每种脂蛋白中的胆固醇浓度。本专利技术更进一步提供胆固醇的定量测定试剂，单独或作为混合物包含用于进行上述方法的与样本中脂蛋白之一具有较强亲合性的化合物、对其他脂蛋白表现较强作用的表面活性剂和胆固醇测定试剂。附图的简要说明附图说明图1显示实施例4方法与常规沉淀法之间的相互关系。图2显示实施例5方法与常规沉淀法之间的相互关系。图3显示实施例6方法与常规沉淀法之间的相互关系。图4显示实施例7方法与常规沉淀法之间的相互关系。实施专利技术的最佳方式本专利技术中，在脂蛋白中的胆固醇与胆固醇测定试剂之间的反应之前，必须加入与样本中脂蛋白之一具有较强亲合性的化合物(以下称之为“选择性亲合剂”)和对其他脂蛋白表现较强作用的表面活性剂(以下称之为“选择性活化剂”)。其中，选择性亲合剂与无需反应或测定的脂蛋白表现相互作用，抑制或禁止这些脂蛋白与胆固醇测定试剂之间的反应。另一方面，当所要反应或测定的脂蛋白和无需反应或测定的脂蛋白存在于相同的系统中时，选择性活化剂对所要反应或测定的脂蛋白表现强烈的作用，加速所要反应或测定的那些脂蛋白与胆固醇测定试剂之间的反应。本专利技术中的选择性亲合剂与一种脂蛋白的亲合性和选择性活化剂对其他脂蛋白的作用必须是相对强的，但不必是绝对强的。其原因是因为当使用它们之一时可能是显著的相对误差当使用二者时能够降低到不发生实际问题的水平。作为用在本专利技术中的选择性亲合剂，可以是与形成无需反应或测定的脂蛋白的脂蛋白表面层的组分表现亲合性的化合物。形成脂蛋白表面层的组分可以是胆固醇、磷脂和脱辅基蛋白质等。作为这样一种选择性亲合剂的实例，可以是皂甙、多烯、胆固醇衍生物、肽、外源凝集素和磷脂衍生物等。作为与胆固醇表现亲合性的皂甙，例如可以是毛地黄皂甙、番茄素(tomatine)等；作为多烯，可以是制霉菌素、非律平、pimacillyn、戊霉素、曲古霉素、制霉色基素、表霉素、两性霉素、etoluscomycin、伯霉素、candigin等；作为胆固醇衍生物，可以是氨基甲酰基甲基]-支链淀粉(缩写为“Chol-AECM-支链淀粉”)等；作为肽，可以是杆菌肽、多粘菌素、铃鹿菌素(suzucasylin)本文档来自技高网...

【技术保护点】
选择性定量胆固醇的方法，包括在与样本中的非测量脂蛋白具有较强亲合性的化合物、对测量脂蛋白表现较强作用的表面活性剂和胆固醇测定试剂的存在下，测定在样本中的测量脂蛋白部分中胆固醇的量。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：山本光章，高桥洋子，谷口由利子，小田原祥子，中西一夫，中村光浩，日野浩一，
申请(专利权)人：第一化学药品株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]