一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的方法技术

一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术首先获得新金色分枝杆菌中胆固醇氧化酶(ChoM)的基因扩增，然后利用pMA5质粒，实现了该基因在模式菌株枯草芽孢杆菌168中的过量表达。本发明专利技术构建以胆固醇为底物全细胞转化为方法的高产胆甾-4-烯-3-酮的枯草芽孢杆菌工程菌株，对该菌株的酶活力及发酵性能进行研究发现胆固醇氧化酶的活力较出发菌株有了明显提高，以0.1％(w/v)胆固醇为底物，全细胞转化24h，底物摩尔转化率达到67％和83％，是出发菌株相对转化率的20和25倍。本发明专利技术为微生物一步发酵法生产胆甾-4-烯-3-酮的工业化提供了有益的指导。

【技术实现步骤摘要】
一种利用重组Bacillussubtilis全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的方法
一种利用重组Bacillussubtilis全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。技术背景甾体药物可通过全合成或对天然甾体化合物的降解和其官能团的转化获得，甾体药物具有很强的抗感染、刚过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。随着时代的不断发展，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物，2000年甾体药物在全球药物市场的销售额已突破200亿美元，约占世界医药总销售额的6％。甾体激素类药物分类：肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等。可治疗阿狄森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。早期合成甾体药物的原料大多从动物组织液中直接提取，由于这些原料的含量低、来源少、合成路线复杂、回收率低、代价高昂，不能满足生产的需要。薯蓣皂素的发现和应用，为甾体药物的工业化生产提供了丰富而又廉价的原料，但是生产过程需要消耗大量的薯蓣皂素，使皂素价格不断上升，增加了生产成本，且生产过程严重污染环境。胆甾-4-烯-3-酮，作为胆固醇的氧化产物，可作为减肥食品添加剂或抗高脂血症药物抑制人体内脂肪的积累防止发生肥胖及相应的一些症状，而且不会出现临床上的异常现象和致癌特征。在治疗肝病和防止皮肤角质化抵抗衰老也具有一定的价值，还可作为合成一些药物激素的重要原料。其合成方法有化学合成法和微生物转化法。微生物法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。世界先进国家目前进行甾体药物制备，大多以动植物甾醇为起始原料进行微生物转化，得到甾体药物中间体后，再进一步制备。胆固醇氧化酶(Cholesteroloxidase，ChOx，EC1.1.3.6)又称3-β-羟基氧化还原酶，是胆固醇代谢过程中的关键酶，属于黄素蛋白酶类，以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基，能专一性地催化胆固醇转化为胆甾-4-烯-3-酮，它作为一种检测用酶，应用于医疗检测领域。同时，在食品开发、医疗保健、临床监测、生物农药等方面具有广泛应用价值。对胆固醇氧化酶(ChOx)的深入研究对整个甾体药物行业的发展意义深远。生产更高附加值的胆甾-4-烯-3-酮最直接有效的方法就是以胆固醇为底物，通过微生物一步转化。近年来，众多学者成功实现了来源于不同菌株的ChOx的外源表达。不同来源的ChOx在大肠杆菌系统中表达时，由于大肠杆菌菌株本身为条件致病菌，所以将ChOx在大肠杆菌中进行异源表达存在一定的安全隐患。本专利技术通过质粒pMA5，实现了分枝杆菌胆固醇氧化酶ChoM1和ChoM2在Bacillussubtilis168中的可溶性过量表达，酶活分别达到5.27U/mg和7.44U/mg，全细胞转化胆固醇24h后转化率达67％和83％。分枝杆菌ChoM在枯草系统中表达及全细胞转化胆固醇均为首次报道，且重组子表达的酶活及胆固醇的转化率均较高。枯草芽孢杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，成为微生物甾醇发酵工业潜在生产菌株。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供：通过基因工程手段来获得具有全细胞转化生产胆甾-4-烯-3-酮能力的微生物的方法。对构建的重组菌株进行酶活力及发酵性能进行研究发现胆固醇氧化酶ChoM1和ChoM2活力分别为出发菌的5.2和7.3倍左右，并且得到了较高的转化率。为微生物发酵生产胆甾-4-烯-3-酮的工业化提供了有益的指导。本专利技术的技术方案：是以基因工程为手段构建一株全细胞转化胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮B.subtilis，以TLC及HPLC为方法检测发酵液中产物的生成，筛选阳性重组子，通过酶活力和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力及底物转化率。本专利技术成功构建了一株以胆固醇为底物全细胞转化为方法的高产胆甾-4-烯-3-酮的枯草芽孢杆菌工程菌株，其胆固醇氧化酶活力和底物转化率较出发菌株有较大提高。主要试剂：胆固醇购自国药集团化学试剂有限公司，胆甾-4-烯-3-酮购自美国SIGMA公司重组菌株构建方法：(1)胆固醇氧化酶(ChOx)基因全序列的克隆根据GENBANK网站公布的MycobacteriumneoaurumstrainNWIBL-01choM1和choM2基因序列(JQ303323.2)，以及pMA5质粒上的酶切位点设计choM1和choM2基因引物。以制备的新金色分枝杆菌染色体DNA为模板，分别以choM1F、choM1R和choM2F、choM2R为引物，通过PCR扩增出choM1和choM2全序列。PCR反应体系：10×ExTaqBuffer5μL，dNTP4μL，模板DNA1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶1μL，ddH2O补齐至总体积50μL。PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，65℃45s，72℃2min，循环35次，72℃10min，12℃10min。(2)重组表达载体pMA5-choM1和pMA5-choM2的构建参照上海捷瑞公司胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，胶回收产物按一定比例与pMD18-Tvector过夜连接，转化E.coliJM109感受态细胞，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamHI/NdeI酶切释放出大小约为2.7kb和1.7kb的基因条带，表明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMD18-T-choM1和pMD18-T-choM2。提取保存于E.coliJM109中的质粒pMA5、pMD18-T-choM1和pMD18-T-choM2，质粒pMA5、pMD18-T-choM1和pMD18-T-choM2经BamHI/NdeI双酶切，胶回收纯化，T4DNA连接酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化E.coliJM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamHI/NdeI双酶切后释放出大小约为7.2kb和1.7kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为pMA5-choM1和pMA5-choM2。(3)重组质粒pMA5-choM1和pMA5-choM2化学转化法转化模式菌株B.subtilis168将经验证构建成功的重组质粒pMA5-choM1和pMA5-choM2用化学转化法转化至模式菌株B.subtilis168中表达。转化方法为采用改进的Spizizen法。(4)重组菌株B.subtilis168阳性转化子的筛选；挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证。(5)重组B.subtilis168培养条件、酶活测定、TLC及HPLC分析培养条件：LB培养基：胆固醇1g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/L，NaCl10g/L(固体培养基加入2％琼脂粉)酶活测定方法：采用比色法测定。具体方法如下：取培养24h的菌液50mL，4℃，8,000r/min离心5min收集菌体，用50mLpH7.0的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，重悬于5ml的该缓冲液中。冰浴中40％功率超声破碎，工作2s间歇5s，工作时间10mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组表达载体pMA5‑choM1和pMA5‑choM2，其特征是：通过PCR技术获得来源于新金色分枝杆菌的choM1和choM2基因，分别与表达载体pMA5连接构建获得。

【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征是：将重组载体pMA5-choM1用化学转化法转化菌株Bacillussubtilis168后获得或者是将重组载体pMA5-choM2用化学转化法转化菌株Bacillussubtilis168后获得；重组表达载体pMA5-choM1或pMA5-choM2是通过PCR技术获得来源于新金色分枝杆菌的choM1和choM2基因，分别与表达载体pMA5连接构建获得，所述choM1基...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，许正宏，邵明龙，张显，徐美娟，杨套伟，李会，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32