将大豆7S球蛋白截短形式的α’链(eα’)克隆并在巴斯德毕赤酵母中表达，所述截短形式的α’链在体内和体外模型中在调控胆固醇和甘油三酯内稳态中有活性。重组多肽跨越从N-端侧的142个氨基酸残基并且包括大豆α’亚基的N-端延伸区。通过常规的生物化学技术纯化eα’多肽并且在人肝细胞瘤细胞系(Hep?G2)中通过监测被标记的LDL的摄取和降解评价所述eα’多肽调节LDL受体活性的潜力。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】参与HEP G2细胞中胆固醇内稳态的大豆7S球蛋白a ’亚基延伸区的克隆、酵母表达、纯化和生物学活性 本专利技术涉及对应天然a ’亚基的N端亲水片段的大豆7S球蛋白的重组a ’片段，它的制备方法和含有它的组合物，在所述组合物中它作为控制胆固醇和甘油三酯内稳态有用的活性成分。
技术介绍
在高胆固醇血症患者的血脂水平的控制中，膳食大豆蛋白作用的是广为接受的问题。在以前的研究中，在体内和体外系统中说明了大豆7S球蛋白的一个亚基，a ’亚基，直接涉及LDL-受体的增量调节，表明通过细胞酶加工很可能产生有生物学活性的，能够调节胆固醇内稳态的(多)肽。天然的7S球蛋白由三个随机组合的、通过不同基因编码的多肽链，a’、a和3亚基组成。成熟的a ’ (登录号P11827UniProtKB/Swiss-Prot数据库)和a链(登录号P13916UniProtKB/Swiss-Prot数据库)共享约145个氨基酸残基的延伸的N端区，在^亚基(登录号P25974UniProtKB/Swiss-Prot数据库)中缺少所述N端区。基于a ’延伸区的特有的氨基酸序列，通过金属亲和色谱纯化此亚基并且将其对高胆固醇血症的大鼠口服施用，因而容许显示它的血浆降脂性质和肝P-VLDL受体的增量调节。在另一方面，由于a ’亚基的分子量约为71kDa，它似乎不可能体内穿越肠屏障而没有修饰。因此，我们的研究指向寻找导致药理学作用的a ’亚基的氨基酸序列。由于三个亚基的核心区具有较多的相似的氨基酸序列，可以想到生物学活性应该存在于延伸区的一个或多个(多)肽中。原则上，a ’和a链的延伸区之间局部的但显著的氨基酸差异将限制导致生物学活性的肽的数目。从这些以前的陈述中，寻求的第一策略是检测HepG2细胞中的多肽和合成多肽对LDL-受体(LDL-R)调节的作用，所述H印G2细胞中的多肽获取自CroksoyK70的体外消化(胃蛋白酶/胰蛋白酶)，所述Crokso/70是在食品治疗高胆固醇血症患者中常规使用的无异黄酮大豆浓缩物，所述合成的肽对应于7S大豆球蛋白亚基之间不同的特定氨基酸序列。在这些研究中获得的结果指出，在暴露于CrokSoyK70的酶消化产物和来自7S大豆球蛋白的小合成肽(2，271Da)的H印G2细胞中，能够诱导显著的LDL-R增量调节，所述酶消化产物具有在3，000到20，OOODa范围内的MW，并以KT4M浓度将所述小合成肽加入细胞。用小肽获得的研究现在仍处于研究中且迄今尚未明确。大豆蛋白的降低胆固醇和甘油三酯的能力是已证实的问题。大豆蛋白膳食是当今治疗高胆固醇血症患者的最有力的膳食工具，因而为管理成人和非常年轻的对象提供了独特的机会。而且，明确地确立在具有高基线程度的胆固醇血症患者中血浆胆固醇降低更多。蛋白质本身降低血胆固醇的假说起于实验研究，所述研究表明膳食中从动物到植物蛋白质的转换激活实验动物的肝脏，以及高胆固醇血症患者的循环淋巴单核细胞中的LDL受体系统。为了鉴定导致降胆固醇作用的大豆蛋白组分，用人肝细胞瘤细胞、系实施体外研究，所述细胞系对调节LDL受体表达和胆固醇生物合成/分解的因子高度敏感。在H印G2细胞中发现从7S大豆球蛋白纯化的a ’亚基增量调节LDL受体并且在胆固醇饲养的大鼠中证实此发现。尽管这些数据支持蛋白质部分导致观察到的生物效应的假说，可对a ’链体内生物学命运提出争论，因为通常通过胃和/或肠蛋白分解酶的作用生产肽和氨基酸。然而，声称越来越多的动物和植物(多)肽起相关的调节功能，通常归因于抗氧化、抗增殖和抗炎效应。对大豆而言，实验证据明确地表明了可吸收肽和更小的紧密蛋白质(例如Bowman-Birk抑制物)的可能性，因而诱发很多效应，包括抗癌、抗炎、放射保护性效应。也已经显示了遗传修饰的大豆(多)肽引发生物学应答，比如低血压效应。最近，已经从大豆水解产物鉴定了衍生自7S球蛋白P链的LDL-R转录模拟肽(FVVNATSN),所述水解产物通过来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的蛋白酶并随后通过化学合成制备。在这种情况下，在暴露于100 y M浓度妝的Hep G2细胞中检测到增加的LDL-R转录(+148%)。已经显示了源自IlS球蛋白的其他肽产生相似但是较低的活性。 将需要使得可获得的较短的多肽维持或甚至提高全长蛋白质的生物学性质。专利技术描述现在已经发现所谓的对应其N端侧的大豆7S球蛋白的a ’延伸区具有有利的生物学活性并且已被证明在LDL吸收和降解上比全尺寸a ’链甚至更有效。因此本专利技术提供了所述a ’延伸区(在下文中称为e a ’)，以及通过克隆、酵母表达和纯化重组多肽制备它的方法，所述重组多肽含有大豆a ’亚基的N端延伸区。为此目的，采用a ’链的N端片段的异源表达。在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的分泌-感受态的酵母细胞中达成目标。纯化重组多肽并在H印G2细胞中评价它的生物学活性。通过使用此生物技术方法，能够获得足够量的重组多肽以在体外试验而且也在体内实验中测试。附图描述图IpPICZ a B-e a ’构建体的概观。e a ’的表达由AOX(醇氧化酶)甲醇可诱导的启动子(5’ AOXI)驱动；a交配因子(a -MF)促进重组蛋白分泌到培养基中；A0X1TT A0X转录终止区。Sh ble基因赋予对zeocin的抗性；pUC Ori :大肠杆菌中高数量质粒拷贝的复制起点。其他缩写指限制酶的切割位置；bp :碱基对。图2重组多肽(e a ’)和野生型大豆a ’亚基的序列比对。星表明两个序列中相同的氨基酸残基。图2A重组多肽(e a ) ’的序列(SEQ IDl)图2B野生型大豆a ’亚基的序列(SEQ ID2)图3A重组巴斯德毕赤酵母培养物的还原条件下的SDS-PAGE 第M道分子重量标志物第I道在用甲醇诱导以前TCA沉淀的培养物上清液(无细胞)。第2道在用甲醇诱导I小时以后TCA沉淀的培养物上清液(无细胞)。第3道在用甲醇诱导8小时以后TCA沉淀的培养物上清液(无细胞)。第4道在用甲醇诱导19小时以后TCA沉淀的培养物上清液(无细胞)。第5道在用甲醇诱导25小时以后TCA沉淀的培养物上清液(无细胞)。图3B e a ’纯化步骤的还原条件下的SDS-PAGE第M道分子重量标志物第I道发酵肉汤的冻干粉第2道DEAE_纤维素150mM NaCl洗脱的级分 第3道DEAE-纤维素250mM NaCl洗脱的级分专利技术详述现在在以下实验部分中将详细描述本专利技术 材料和方法 酵母、细菌株和化学品。巴斯德毕赤酵母X33 (WT)菌株(Invitrogen, San Diego,CA)用于酵母表达。遗传操作使用的细菌株为大肠杆菌XLl-Blue (Invitrogen, San Diego,CA)。限制酶 Pst I 和Xba I 购自 Roche (Indianapolis, IN), Sac I 来自 Fermentas (Ontario,Canada) Taq DNA 聚合酶购自 Invitrogen (San Diego, CA)。Zeocin 购自 Invivogen (SanDiego, CA)。PCR的寡核苷酸获取自Primm(Milano,意大利)。蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：P·莫拉佐尼，A·里瓦，C·蓬佐内，D·贝兰达，M·杜兰蒂，A·康索尼，
申请(专利权)人：因德纳有限公司，
类型：发明
国别省市：
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