检测诱捕受体3单克隆抗体,产生该抗体的杂交瘤及其用途制造技术

本发明专利技术提供抗诱捕受体３（ＤｃＲ　３）的单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤，含此单克隆抗体的试剂盒，以及利用此杂交瘤、抗体及试剂盒检测诱捕受体３相关性疾病，以及治疗及／或预防诱捕受体３相关的疾病。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,产生该抗体的杂交瘤及其用途的制作方法
本专利技术涉及诱捕受体3(Decoy Receptor3)的单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤，含此单克隆抗体的试剂盒，以及利用此杂交瘤、抗体及试剂盒检测诱捕受体3相关性疾病，治疗及/或预防诱捕受体3相关疾病。
技术介绍
肿瘤坏死因子及其受体(TNF/TNFR)家族蛋白在复杂的生物调节体系中扮演极重要的角色，例如，细胞增殖与分化、细胞存活与死亡、细胞激素的产生和免疫细胞的活化等。而在这个家族中，有多个成员和传达细胞凋亡信息及调控免疫系统特别有关。目前属于TNF受体超级家族(superfamily)分子中的成员，大部分具有死亡区域(death domain)，并且能传递死亡信息；这些成员包括TNFR-1、CD95/Fas/APO-1、DR3/TRAMP/APO-3、DR4/TRAIL-R/APO-2、DR5/TRAIL-R等。此超级家族在分子结构上有一共同点，即在细胞外部区域含有3到6个重复半胱氨酸(cysteine)的区域且氨基酸序列相当类似。另外，这些死亡受体也以在羧基端带有一段由约80个氨基酸所组成的，具有保留性的死亡区域为特征(于等人，生物化学1999 274(20)，Yu K.Y，et al 1999，J.Biol.Chem.274(20)13733-13736)。目前已知此段信息序列对于传递死亡信息是必须且重要的，借由此段死亡区域活化一连串的原细胞凋亡蛋白酶水解酶(pro-apoptotic protease caspase)，使细胞因染色体DNA的瓦解，而引导细胞走向自然凋亡之路(Sheikh，MS and Fomace，AJ，Jr.，2000，Leukemia 141509-1513；Douglas R.Green，1998，Nature，396629-630)。近来Avi Ashkena Zi等人在自然杂志(Nature，396699-703，1998)上发表，利用搜寻EST资料库发现一新的受体成员，DcR3/TR6，发现诱捕受体3(Decoy Receptor 3；DcR3)的信使RNA(mRNA)会特别表现在肺部组织、大肠直肠腺癌和某些内皮细胞株上，在经由PMA/伊诺霉素(ionomycin)刺激的Jurkat细胞株上亦会诱发DcR3mRNA的表达；DcR3有4个富含半胱氨酸的区域，而且它是可溶性蛋白，同时也发现DcR3会与LIGHT及FasL/CD95L相结合，并抑制LIGHT及FasL/CD95L所调节的细胞毒杀作用(Yu K.Y.etal.，supra)。已知LIGHT为HVEM/TR2及LTβR的配体(ligand)，在活化的T细胞及巨噬细胞上有高量的表达；而LIGHT会借由LTβR信息传递造成某些腺癌肿瘤细胞株的细胞凋亡。此外，细胞自然凋亡在免疫反应中有许多方面皆是借助FasL-Fas系统来执行，例如，外周血液系统的克隆删除(peripheral Clonal deletion)，克隆放大(clonal expansion)的控制及毒杀性T细胞活性的调节等，都是藉由Fas及其配体FasL所共同调节的。罗博特等人(Robert M.Pitti，et al.)研究发现(自然Nature，396699-702，1998)，DcR3会与Fas相互竞争与FasL的结合，以抑制FasL所传递的死亡信息，因此推论体内某些肿瘤细胞可藉由表达大量的DcR3而躲避免疫系统的攻击。DcR3的基因首先是由人类的肺癌及直肠癌中分离出来，并显示在消化道肿瘤组织内具有表达性。(张等人Chang，B.et al.PNAS，97(3)1230-1235，2000)曾利用DcR3的片段制备抗体，并以此作为组织免疫染色的检验。然而，该篇文献中仅涉及制备抗DcR3的多克隆抗体(polyclonal antibody)作为免疫染色之用，并且仅显示mRNA的表达量，因此，不论是在抗体的特异性(specificity)或是检测的时间、成本上，都不是理想的方法。此外，该文献中更无具体提出DcR3是否确实存在于血清中，并且也没有揭示其可应用于临床诊断疾病的方法。对于疾病的检测，特别是与癌症相关的疾病，需要一种快速、有效且准确的方法，才能容易地筛选出癌症前期的病患，早期接受更精密的检查或进一步的治疗。此外，对于一些具有家族病史的高危险族群及癌症预后的病患而言，简易、方便、快速且准确的检测方法，可有效地定期追踪特定的疾病，以达到早期发现早期治疗的效用。酶连结免疫吸附分析法(ELISA)已广泛应用于各种疾病的检测，其准确率几乎是与所发展的抗体成正相关，因此，对于寻找一种可检验多样癌症的标识蛋白，并发展相关的检验试剂盒，有其急迫的需求。本专利技术的第二个目的是提供可产生该单克隆抗体的杂交瘤； 本专利技术的第三个目的是提供一种包括诱捕受体3与一免疫球蛋白的恒定区片段的融合蛋白，以及包括此融合蛋白的医药组合物；本专利技术的第四目的是提供一种检测诱捕受体3相关性疾病的试剂盒，包括(i)一种由杂交瘤9A10C3所分泌的特异性抗诱捕受体3的单克隆抗体，以及另一由杂交瘤3H5所分泌的特异性抗诱捕受体3的单克隆抗体；(ii)一支持工具，其上粘附杂交瘤9A10C3所分泌出的特异性抗诱捕受体3的单克隆抗体；(iii)一清洗溶液；以及(iv)一信号产生工具，其可操作性地与由杂交瘤3H5所分泌的特异性抗诱捕受体3的该单克隆抗体连结而产生信号。本专利技术的第五个目的是提供一种检测诱捕受体3含量的方法，包括下列步骤(a)提供一种由杂交瘤9A10C3所分泌抗特异性抗诱捕受体3的单克隆抗体；(b)使该单克隆抗体粘附在一支持工具上，以形成一抗体—支持物共轭体；(c)使检测样品或诱捕受体3标准液与该抗体—支持工具共轭体接触；(d)以一清洗溶液进行清洗步骤；(e)提供一信号产生工具，其可操作性地与由杂交瘤3H5所分泌的特异性抗诱捕受体3的单克隆抗体连结而产生信号；以及(f)测量该信号产生工具所产生的信号。为了让本专利技术之上述和其他目的、特征，及优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，做详细说明如下 图2为显示本专利技术检测试剂盒的标准定量曲线。图3为显示以本专利技术的检测试剂盒对各种癌症病患血清样品进行分析的结果，其中，N代表受测样品数。图4为显示以本专利技术检测试剂盒对各种与DcR3有关的非癌症病患的血清样品进行分析的结果，其中，N代表受测样品数。具体实施例方式有鉴于诱捕受体3(在本说明书的内文中简称为DcR3)可能在特定的组织及环境中表达，本专利技术的专利技术者因此而研究开发高特异性的抗DcR3单克隆抗体，并借此筛选多种疾病(例如，各种癌症、红斑狼疮症、乙型肝炎、过敏症及后天性免疫缺欠综合征)，以期能够开发出可针对与DcR3具有相关性疾病的检测试剂盒，以提供另一种早期筛选重症疾病的途径。本专利技术利用现有资料库上的基因序列，从人类胎儿肺部的互补DNA(cDNA)资料库中，以聚合酶链(式)反应(PCR)扩增得到人类DcR3的cDNA片段，然后扩增到含有免疫球蛋白恒定区片段(Fc)的部份相接，并在适当的宿主细胞中表现DcR3-Fc的融合蛋白。上述的扩增方法是分子生物学领域技术人员所熟知的，并将于以下的实施例中详细说明，其中，将DcR3与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杂交瘤３Ｈ５，它产生对抗诱捕受体３（ＤｃＲ ３）的单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：麦胜智，刘士任，季匡华，
申请(专利权)人：华星生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]